人參總皂苷防治原發性骨質疏松

俞之胤 李曉華 隋 欣 楊 擎 石曉征 李 娜 韓 冬 于 澎 王 建

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

老年性骨質疏松為原發性骨質疏松疾病，主要臨床表現為患者骨密度(BMD)低下、骨脆性增加，常見患病人群為絕經期婦女，是一種發病率高的全身性骨代謝疾病。人參為五加科草本植物〔1〕，活性成分包含蛋白、多肽、氨基酸、揮發油、多糖、微量元素及人參皂苷〔2～6〕，其中以人參皂苷為主要功效學物質基礎。人參臨床應用集中在抗氧化、調節心血管系統、抗腫瘤、提高機體免疫等〔7～13〕。人參皂苷可促進骨生長發育、預防骨質疏松。本研究觀察人參總皂苷對大鼠體內堿性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白(BMP)、Smad1的調節作用，探討人參總皂苷抗骨質疏松的治療效果和分子作用機制。

1 材料與方法

1.1動物、藥品、試劑及儀器 清潔級雌性SD大鼠，體重(200±10)g，購于長春市憶斯實驗動物有限責任公司，動物生產許可證：SCXK(吉)2011-0004。人參總皂苷購于長春賽信生物科技有限公司。倍美力，雌激素類藥物(購于惠氏制藥有限公司)。RNA制備試劑(天根公司)，qRT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，蛋白裂解液(北京鼎國公司)，ALP抗體(OminmAbs公司)，考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒(上海美季生物)，Smad1抗體(美國Proteintech公司)，BMP抗體(美國Proteintech公司)。引物由長春百金生物公司代理合成。qRT-PCR儀(德國艾本德公司)；酶標儀(瑞士帝肯公司)。X-射線骨密度儀(美國LUNAR公司)；蛋白電泳(美國通用公司)；離心機(德國艾本德公司)；核酸提取構建儀(瑞士帝肯公司)；核酸電泳(美國伯樂公司)；恒溫水浴(美國賽墨菲公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 隨機將60只雌性大鼠分為空白組、模型組、陽性組、人參總皂苷高、中、低劑量組。空白組大鼠進行假手術處理，剔除卵巢周圍脂肪組織，其余組大鼠均進行雙側卵巢摘除手術(OVX)，建立原發性骨質疏松大鼠模型，手術后給予1 w的青霉素治療。

1.2.2給藥 采用灌胃給藥方式，人參總皂苷低、中、高劑量組給藥量分別為20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，陽性組給藥量為0.05 mg/kg倍美力，其余組給予等體積的生理鹽水。90 d后，脫臼處死所有動物，留取股骨備用。

1.2.3BMD測量 利用X-射線BMD儀，檢測手術前和治療結束時各組大鼠股骨BMD，比較人參總皂苷治療前后大鼠股骨BMD變化，觀察人參總皂苷防治骨質疏松的作用效果。

1.2.4檢測ALP、BMP、Smad1表達 引物設計及總RNA制備：利用NCBI檢索大鼠ALP、BMP、Smad1的全長基因堿基序列，應用Primer Premier 6.0軟件，設計PCR特異性引物ALP、BMP、Smad1，由長春百金生物公司提供合成服務，ALP正義鏈：ATGCCCTGAAACTCCAAA，反義鏈：TCTCCAGCCGTGTCTCCTC；BMP正義鏈：GGACTGCGGTCTCCTAAA，反義鏈：CAGCCTCAACTCAAACTCG；Smad1正義鏈：CACTATTGAAAACACCAGGCGGCAT，反義鏈：：GCTACTGTCACTAAGGCATTCGGCA；β-actin正義鏈：TTACTGCCCTGGCTCCTA，反義鏈：ACTCATCGTACTCCTGCTTG。利用磁珠法在全自動核酸構建儀中制備總RNA，樣品溶于無菌水中。經10%核酸電泳檢測RNA純度，觀察28 S和18 S含量，并進行質量評價；分光光度法測定RNA濃度，并將各組RNA濃度定量為50 ng/μl。然后將各組總RNA反轉錄成cDNA。Real-time PCR實驗：在PCR反應管中，依次加入SYBR Primex、cDNA模板、上游引物和下游引物；用滅菌水補至20 μl，建立RCR反應體系。采用“兩步法”PCR擴增標準程序〔14～16〕，反應體系為20 μl。擴增結束后統計CT值，應用“2-△△Ct”法觀察人參總皂苷對ALP、BMP、Smad1 mRNA表達的調控作用。

1.2.5Western印跡實驗 總蛋白樣品的制備及定量：將儲存在-80℃條件下的股骨研磨至細粉，按固液比1∶10加入組織裂解液，轉移到離心管中，加入適量苯甲基磺酰氟(PMSF，100×)，冰浴裂解2 h。12 000 r/min、離心10 min，上清液為股骨總蛋白。采用考馬斯亮藍法制作蛋白標準曲線。用純水將各組蛋白濃度定量至同一水平，進行Western印跡實驗，觀察人參總皂苷對ALP、BMP、Smad1蛋白表達的影響。免疫印跡法檢測ALP、BMP、Smad1蛋白表達：將定量后的蛋白樣品加熱變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測。將膠片轉移至三層濾紙上，加蓋硝酸纖維素薄膜(PVDFC)膜，覆蓋3層濾紙，固定后，轉膜70～90 min。依次進行洗滌、牛奶封閉、洗滌，一抗、二抗封閉，最后進行電化學發光(ECL)法顯色，在凝膠成像儀中觀察各組ALP、BMP、Smad1蛋白情況。

1.3統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組BMD比較 手術前各組股骨BMD水平差異無統計學意義(P>0.05)；治療90 d后，與空白組比較，模型組BMD顯著降低(P<0.01)，證實造模成功。治療90 d后，與模型組相比，陽性組BMD顯著升高(P<0.01)，人參總皂苷高、中劑量組BMD均增加明顯(P<0.05)，低劑量組也有增加趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達水平比較 將制備的總RNA樣品進行瓊脂糖電泳檢測，電泳結果見圖1。圖中28 S和18 S條帶清晰可見，經比對marker，其堿基數吻合，總RNA純度高，經過對總RNA質量評價，基本滿足熒光定量PCR實驗要求。與空白組比較，模型組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性組及人參總皂苷高劑量組ALP、BMP、Smad1的mRNA表達均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，中劑量組BMP mRNA表達也顯著升高(P<0.05)，且中劑量組ALP、Smad1 mRNA及低劑量組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達有上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組ALP、BMP、Smad1蛋白表達情況比較 與空白組比較，模型組ALP、BMP、Smad1蛋白表達均顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，陽性組、人參總皂苷高、中劑量組ALP、BMP及Smad1蛋白表達均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，低劑量組呈現升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

表1 各組股骨BMD比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01；下表同

1～6：空白組、模型組、陽性組、高、中、低劑量組；M:marker圖1 各組大鼠股骨總RNA電泳圖

表2 各組ALP、BMP、Smad1 mRNA水平比較

圖2 各組ALP、BMP、Smad1蛋白表達

表3 各組ALP、BMP、Smad1 蛋白相對表達量的比較

3 討 論

BMD是目前診斷骨質疏松的重要風險標記物，且利用骨密度儀照射大鼠股骨，操作簡單且數據可靠。ALP是一大類同工酶，廣泛分布于骨骼中，ALP活力的變化是臨床上檢測各類骨骼疾病的重要指標，臨床常被用作評價骨形成和骨轉化的檢測指標。BMP和Smad1是轉化生長因子(TGF)-β信號通路的主要成員，其中BMP是一種骨成型蛋白，作為重要的細胞因子主要游離在細胞外，起調控成骨細胞分化和骨形成的作用〔17〕。通過與其受體作用后，特異復核Smad1/5/8，進而作用細胞核內的Smad4來調節骨代謝平衡〔18,19〕。所以初步猜想人參皂苷有調節骨代謝的作用，可能是通過調控BMP/Smad1信號通路來實現的。目前原發性骨質疏松臨床診療標準明確，臨床用藥治療多集中在西藥及聯合用藥，如雙磷酸鹽類、鈣劑、VitD或K2、降鈣素、雌激素類、甲狀旁腺素類、鍶劑、雌激素受體調節劑〔20，21〕。研究者們〔22～24〕開展了補虛中藥及復方在骨質疏松治療中的研究，證實了多種中藥或復方可能有抗骨質疏松的作用。本研究證實人參總皂苷能改善大鼠股骨BMD，同時調控ALP、BMP、Smad1 mRNA表達水平和蛋白表達水平一致。證實人參提取物在防治骨質疏松中可能發揮一定的防治作用，但具體是人參中哪種皂苷發揮作用或起主導作用，還需后期進行多種人參皂苷單體的篩選和驗證。為進一步闡述人參皂苷抗骨質疏松分子作用機制，作者將利用二維電泳-質譜聯合應用技術建立骨質疏松模型組和治療組的蛋白組學分析，比較二者之間顯著差異表達的蛋白，然后利用qRT-PCR技術，驗證相關基因的差異表達，需找調控骨質疏松的功能蛋白。并借助功能蛋白作用的信號通路闡述人參皂苷治療骨質疏松的作用機制。