九龍蟲對慢性支氣管炎大鼠血漿及肺組織SP和VIP的影響

潘朝旺 楊家林 周先云 王 偉 萬進(jìn)軍 祁學(xué)章

(鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 鄂州 436000)

慢性支氣管炎是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果〔1〕。臨床上以咳嗽、咳痰及喘息為主要表現(xiàn)，且受生活習(xí)慣及氣候環(huán)境影響，該病嚴(yán)重時可發(fā)展為肺源性心臟病，因此發(fā)現(xiàn)和尋找對慢性支氣管炎療效好、安全性高的藥物具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。本實(shí)驗擬通過觀察九龍蟲對慢性支氣管炎模型大鼠體重、支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)、分類及血漿和肺組織P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)的影響，探討其抗慢性支氣管炎的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物 Wistar雄性大鼠60只，體重(200±20)g，SPF級，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物研究中心提供，動物合格證號：SYXK(湘)2013-0005。

1.2藥物與試劑 九龍蟲散，本院自制，用前配成混懸液；大鼠SP(20160715)、VIP酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(20160806)，深圳子科生物科技有限公司；桂龍咳喘寧膠囊，桂龍藥業(yè)(安徽)有限公司，批號：20160106。

1.3儀器 μs-2200全自動五分類血液細(xì)胞分析儀，深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；臺式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司；PT-MR3100D組織勻漿機(jī)，瑞士Polytron公司；9602A酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司；UV754紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；NE-C28 歐姆龍壓縮式吸入器，歐姆龍(大連)有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，上海豫明儀器有限公司。

1.4動物造模及分組給藥 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組、九龍蟲高、中、低劑量組，除正常組外，在參照文獻(xiàn)〔2〕的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立脂多糖霧化慢性支氣管炎大鼠模型：第1天將大鼠麻醉(1%戊巴比妥鈉，劑量50 mg/kg)，固定，暴露聲門，用靜脈導(dǎo)管針套管向氣管內(nèi)快速注入1 mg/ml脂多糖溶液200 μl(正常組將0.1%脂多糖換成生理鹽水進(jìn)行同樣操作)；從第2天開始，將大鼠分置在自制的50 cm×60 cm×40 cm的玻璃箱中，霧化吸入50 μg/ml脂多糖溶液(正常組將50 μg/ml脂多糖換成生理鹽水進(jìn)行同樣操作)，每次1 h，每天1次，連續(xù)28 d。從第1天開始，正常組及模型組給予生理鹽水15 ml·kg-1·d-1，陽性對照組給予桂龍咳喘寧膠囊混懸液0.75 g·kg-1·d-1，九龍蟲高、中、低劑量組分別給予九龍蟲混懸液0.04、0.02、0.01 g·kg-1·d-1，連續(xù)給藥35 d，稱重。

1.5一般情況 觀察并記錄大鼠活動狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食飲水及死亡數(shù)量，記錄造模前及最后一次給藥后的體重變化。

1.6支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)及分類 將大鼠取血后(血液另作他用)處死，參照文獻(xiàn)〔3〕，暴露氣管及肺部，反復(fù)灌洗左肺3次，方法：結(jié)扎右主支氣管，用注射器抽取生理鹽水2 ml，從隆突上穿刺至左肺，沖洗，回收灌洗液共約4.5 ml。用全自動五分類血液細(xì)胞分析儀檢測灌洗液白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.7血清SP、VIP測定 末次給藥24 h后，將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血約5 ml，4 000 r/min離心10 min，制備血清，嚴(yán)格按試劑盒說明采用ELISA法測定SP、VIP含量。

1.8肺組織SP、VIP測定 取大鼠右肺中葉肺組織約1.0 g，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸濕，稱重，剪碎，加入9倍冷生理鹽水，用組織勻漿機(jī)勻漿10 min后再用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎10 min，4 000 r/min離心10 min，嚴(yán)格按試劑盒說明采用ELISA法測定SP、VIP含量。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況比較 造模后，模型組大鼠出現(xiàn)活動減少，倦怠，皮毛枯燥松弛并逐漸失去光澤，還出現(xiàn)咳嗽及喘息等，陽性對照組和九龍蟲各劑量組上述情況明顯改善；與正常組比較，模型組大鼠給藥后體重及體重增加量明顯減少(P<0.01)，而各給藥組體重及增加量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見表1。

2.2各組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)及分類比較 與正常組比較，模型組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比升高，而巨噬細(xì)胞百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但淋巴細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各給藥組與模型組比較，白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比降低，巨噬細(xì)胞百分比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；但淋巴細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3各組血清、肺組織SP、VIP比較 模型組血清、肺組織SP水平明顯高于正常組，VIP水平明顯低于正常組(P<0.01)。各給藥組血清、肺組織SP水平明顯低于模型組，而VIP水平明顯高于模型組(P<0.05或P<0.01)。與正常組比較，九龍蟲低劑量組血清、肺組織SP水平顯著升高，VIP水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表1 各組大鼠體重比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；同表2

表2 各組支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)及分類比較

表3 各組血清、肺組織SP、VIP比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.05

3 討 論

慢性支氣管炎作為呼吸系統(tǒng)的一種常見病，特別是老年人由于身體功能下降，發(fā)病率較高，危害較大〔4，5〕。神經(jīng)肽作為存在于神經(jīng)組織并參與神經(jīng)系統(tǒng)功能作用的內(nèi)源性活性物質(zhì)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種多樣的生理功能，具有含量低、活性高、作用廣泛而又復(fù)雜的特點(diǎn)。神經(jīng)肽既存在于神經(jīng)組織，同時也在腸、肺、腦等外周器官和組織廣泛分布。

SP是一種含有11個氨基酸的由非腎上腺能非膽堿能興奮性神經(jīng)釋放的神經(jīng)肽，廣泛分布于細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)，在中樞神經(jīng)末梢釋放的SP與痛覺傳遞有關(guān)，而外周神經(jīng)末稍釋放SP，在支氣管和肺組織中分布廣泛，可與肺血管平滑肌上SP受體特異性結(jié)合發(fā)揮生理效能，其受體NK-1R在肺間質(zhì)細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、各種炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞表面均有表達(dá)。在生理濃度下，SP可舒張肺血管，增加血流量及增強(qiáng)血管通透性，但是在高濃度下，SP則使舒張的肺血管發(fā)生收縮效應(yīng)。SP還具有促炎癥作用，與T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體及單核巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)、多形核白細(xì)胞呼吸爆發(fā)等功能有關(guān)〔6〕，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在氣道周圍浸潤，氣道平滑肌收縮，黏液分泌增加，血管擴(kuò)張、通透性增加等。研究發(fā)現(xiàn)，SP水平升高可引起氣道平滑肌收縮，氣道黏膜腺體分泌增強(qiáng)，導(dǎo)致炎性浸潤反應(yīng)〔7〕。另外研究表明，SP與慢性阻塞性肺疾病、哮喘的氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的形成有密切關(guān)系〔8〕。慢性支氣管炎由于氣道炎癥，導(dǎo)致氣道上皮損傷甚至脫落，前列腺素等炎癥因子可刺激裸露的神經(jīng)末梢，引起SP釋放；由于氣道上皮損傷或脫落，使降解SP的內(nèi)肽酶減少，導(dǎo)致SP升高。本實(shí)驗提示九龍蟲對慢性支氣管炎有治療作用。

VIP是由含170個氨基酸的前血管活性腸肽原經(jīng)酶解而成的二十八肽的一種神經(jīng)遞質(zhì)，是非腎上腺能非膽堿能抑制性神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)合成后經(jīng)局部神經(jīng)纖維末梢釋放，釋放VIP的神經(jīng)纖維在人體廣泛分布，參與機(jī)體消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、心血管等的功能調(diào)節(jié)，還對炎癥介質(zhì)的釋放具有較強(qiáng)的抑制作用，此外，還參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。VIP在胃腸道中含量最高，參與松弛胃腸平滑肌，促進(jìn)腺體分泌等作用〔9〕。VIP是已知的肺組織最豐富的神經(jīng)多肽之一，在呼吸系統(tǒng)氣道平滑肌、黏膜下腺體、血管壁和肺組織的膽堿能神經(jīng)節(jié)前纖維及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，廣泛存在VIP能神經(jīng)纖維，VIP受體在肺血管平滑肌、大氣道平滑肌、氣道上皮和黏膜下腺體內(nèi)具有高密度分布〔10〕。VIP具有強(qiáng)大的抗炎作用，抑制嗜酸性粒細(xì)胞的釋放和黏附，并對抗白三烯、內(nèi)皮素、組胺等引起的支氣管平滑肌收縮作用。當(dāng)呼吸系統(tǒng)受到刺激時，VIP和乙酰膽堿都釋放增加，乙酰膽堿使氣道收縮及血管通透性增加，而VIP可以減弱乙酰膽堿的上述作用，還參與機(jī)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，抑制炎癥介質(zhì)的釋放；當(dāng)體內(nèi) VIP含量減少時，機(jī)體抗炎作用減弱，炎癥介質(zhì)釋放增加，支氣管收縮作用增強(qiáng)，血管通透性增加，加重慢性支氣管炎癥狀。本實(shí)驗提示九龍蟲對慢性支氣管炎有治療作用，可降低慢性支氣管炎模型大鼠SP水平，增加VIP水平，為其用于慢性支氣管炎的治療提供了實(shí)驗依據(jù)。