多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)性與帕金森病的易感性及PET/CT顯像

常培葉 趙 平 王雪梅 王春梅 包寶亮

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

帕金森病(PD)是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性，導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺含量減少，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、自主運(yùn)動(dòng)減少等。PD發(fā)病率隨著年齡增加而逐漸升高，在我國北京、西安和上海的PD流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PD在65歲以上人群中的發(fā)病率為1.7%，已經(jīng)接近發(fā)達(dá)國家〔1〕。研究認(rèn)為PD是一種復(fù)雜的多因素疾病，它的發(fā)病受到環(huán)境〔2〕和遺傳因素的共同影響，其中遺傳因素起主要作用〔3〕。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT，基因名：SLC6A3)是調(diào)節(jié)突觸間隙多巴胺濃度的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，DAT的主要功能是對(duì)釋放到突觸間隙的多巴胺進(jìn)行再攝取，從而終止神經(jīng)細(xì)胞間的信息傳遞〔4〕。研究〔5，6〕表明，DAT基因變異與PD的易患性有關(guān)。本研究DAT基因3′非翻譯區(qū)可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)PD的相關(guān)性，分析VNTR多態(tài)性與紋狀體DAT11C-甲基-N-2β-甲基酯-3β-(4-F-苯基)托烷(11C-β-CFT)腦顯像攝取之間的關(guān)聯(lián)性，探討DAT基因VNTR變異在內(nèi)蒙古地區(qū)PD發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 選取2015年就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診及住院的PD患者52例為PD組，其中男23例，女29例；年齡40～70歲，平均(62±3.24)歲；霍思亞布爾(Hoehn-Yahr)評(píng)分1.0～2.0，平均1.5。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合英國PD協(xié)會(huì)腦庫標(biāo)準(zhǔn)制定的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)，以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)會(huì)制定的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)。②患者口服美多巴制劑后療效明顯，且均未接受過PD顱內(nèi)手術(shù)治療。③排除帕金森綜合征、腦血管疾病、中毒、顱內(nèi)感染、顱腦外傷等器質(zhì)性病變，以及血管性癡呆、路易體癡呆、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。④排除陽性家族史，即該P(yáng)D患者的一級(jí)或二級(jí)親屬，既往均無PD、阿爾茨海默病、路易體癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢人員60例為對(duì)照組，男29例，女31例，年齡40～70歲，平均(54±2.58)歲。入選者為與PD組患者年齡、性別匹配的健康志愿者，且滿足以下條件：①對(duì)照組與PD組及對(duì)照組個(gè)體之間均無血緣關(guān)系。②排除PD、阿爾茨海默病、路易體癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病病史，且無服用精神病藥物史。兩組均知情同意且性別、年齡一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2DAN提取方法 采用試劑盒法進(jìn)行DNA的提取并進(jìn)行DNA濃度、純度檢測(cè)。

1.3VNTR多態(tài)位點(diǎn)基因分型方法 采用高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)進(jìn)行VNTR多態(tài)位點(diǎn)的基因分型。①PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：1×緩沖液2 μl，20 ng 模板1 μl，3 mmol/L鎂離子(Mg2+)0.6 μl，2 mmol/L/脫氧核苷三磷酸(dNTP)2 μl，1 U DNA聚合酶(Taq)0.2 μl，1×溶液4 μl，0.5p引物混合物2 μl，水8.2 μl，總體積20 μl。PCR 反應(yīng)條件：起始95℃變性15 min，然后94℃ 30 s，62℃ 1 min，72℃ 1 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。②LDR進(jìn)行基因分型。LDR反應(yīng)體系如下：1×緩沖液1 μl，12.5 pmol/μl/探針混合物1 μl，2 U連接酶0.05 μl，100 ng/μl PCR產(chǎn)物1 μl，水6.95 μl，總體積10 μl。反應(yīng)條件：95℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 2 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用GeneMapper 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

1.411C-β-CFT DAT正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)/CT腦顯像 20例臨床確診PD患者和10例對(duì)照者使用GE Discovery 710 顯像設(shè)備進(jìn)行DAT PET-CT顯像研究，受試者經(jīng)肘靜脈注射11C-β-CFT 30 min后進(jìn)行DAT腦顯像，采集模式為3D，發(fā)射采集計(jì)數(shù)為3×10計(jì)數(shù)，取CT圖像中紋狀體影像最清晰的3幀橫斷層圖像，在每一層面上分別勾畫出雙側(cè)尾狀核、雙側(cè)殼核及小腦(CB)感興趣區(qū)(ROI)，用計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)得出各ROI的平均放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算各區(qū) DAT 結(jié)合量指數(shù)：(ROI-CB)/ CB，以三層的平均計(jì)數(shù)計(jì)算此比值，獲得這些區(qū)域的11C-β-CFT攝取指數(shù)，以此來反映這些區(qū)域DAT的數(shù)量。為保證 ROI 的大小與位置在每一位受試者間的一致性，ROI均由 1 名核醫(yī)學(xué)專業(yè)主治醫(yī)師獨(dú)立勾畫。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1VNTR多態(tài)性分析 VNTR的基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。VNTR有9R和10R兩個(gè)等位基因，VNTR基因型頻率和等位基因頻率在對(duì)照組和PD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2紋狀體11C-β-CFT放射性計(jì)數(shù)分析 對(duì)照組DAT顯像清晰放射性攝取均勻?qū)ΨQ。與對(duì)照組比較，PD組雙側(cè)尾狀核、前殼核和后殼核攝取11C-β-CFT放射性計(jì)數(shù)比值顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、圖2、表2。

表1 兩組VNTR基因多態(tài)性比較〔n(%)〕

圖1 對(duì)照組11C-β-CFT-PET-DAT腦顯像圖

圖2 PD組11C-β-CFT-PET-DAT腦顯像圖

表2 兩組紋狀體11C-β-CFT-PET-DAT顯像結(jié)果比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3相關(guān)性分析 紋狀體11C-β-CFT放射性計(jì)數(shù)與VNTR的10R-10R、10R-9R、9R-9R的基因型頻率無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

人類DAT基因由SLC6A3基因編碼，位于染色體5pl5.3，包含15個(gè)外顯子，全長(zhǎng)64 Kb。其編碼區(qū)表現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性，因此SLC6A3基因表達(dá)的個(gè)體差異可能來自于調(diào)控序列，研究較多的是其3′非翻譯區(qū)(3′UTR)一個(gè)40 bp串聯(lián)重復(fù)序列VNTR的多態(tài)性，有研究表明，VNTR多態(tài)會(huì)影響DAT基因的表達(dá)，并與PD的易患性有關(guān)〔7〕。在高加索人群和中國廣州人群的兩項(xiàng)研究中均發(fā)現(xiàn)11次拷貝重復(fù)等位基因?qū)е禄虮磉_(dá)的增強(qiáng)，使神經(jīng)毒素進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元增多，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性壞死〔8〕。但部分研究結(jié)果不支持DAT基因多態(tài)與PD的關(guān)聯(lián)〔9〕，其原因可能在于人種、種群和地域的差異。借助單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(SPECT)和PET技術(shù)，使人們能夠在活體內(nèi)對(duì)與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)〔10〕，相比于SPECT顯像，PET顯像具有更高的空間分辨率和圖像質(zhì)量，顯示出更明顯的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)〔11〕。研究〔12〕表明，PD患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元的變性脫失伴隨突觸前膜DAT數(shù)量及功能的明顯下降，兩者的變化相一致。DAT顯像可用于評(píng)價(jià)紋狀體突觸前的多巴胺能神經(jīng)纖維末梢的功能狀態(tài)，是目前最敏感的PD標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)DAT基因的VNTR 3種基因型頻率分布在對(duì)照組和PD組并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且未發(fā)現(xiàn)紋狀體11C-β-CFT放射性計(jì)數(shù)與VNTR基因型之間的相關(guān)性。這可能是由于樣本量太小，在今后的研究中需增加樣本量，根據(jù)年齡、性別及發(fā)病特征等進(jìn)行詳細(xì)分類統(tǒng)計(jì)。盡管本研究未能得出基因位點(diǎn)突變與PD遺傳易感性有關(guān)的結(jié)論，但這并不能排除其在PD發(fā)病中的作用， 有待進(jìn)一步研究。