胱抑素C、尿微量白蛋白肌酐比值與胱抑素C基因多態性老年糖尿病視網膜病變的相關性

黃秋菊 李玉蘭 韋秀英 馬 翔 周 玉 龍入虹 鐘 萍

(柳州市人民醫院內分泌科，廣西 柳州 545006)

糖尿病視網膜病變(DR)是2型糖尿病(T2DM)最常見的周圍神經病變相關的并發癥，是造成T2DM患者視力下降、視野缺損或致盲的主要原因，T2DM患者中DR發病率為60%～90%，其中視力喪失者占8%。目前DR的發病機制尚不清楚，探索發病機制對于DR治療具有重要意義〔1～3〕。胱抑素(Cys)-C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，早前作為反映腎小球濾過率及腎功能的指標，近年來發現Cys-C參與心血管系統的病理過程，而且是諸多心血管事件的獨立危險因素，具有較強的預測功能〔4，5〕。尿微量白蛋白肌酐比值(ACR)，尤其是首次晨尿ACR有著很好的穩定性，作為敏感指標，可較好地反映早期腎功能損傷。研究顯示Cys-C基因多態性可影響外周血Cys-C表達〔6〕，因此部分患者即使存在腎功能損傷，外周血Cys-C水平并不明顯增高，但也有研究表明Cys-C基因多態性與外周血Cys-C水平無關〔7〕。本課題擬考察Cys-C和ACR與DR的關系，為DR的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 經院內倫理委員會同意，選取2011年8月至2016年8月柳州市人民醫院就診的T2DM患者126例，根據2002年國際分級標準〔8，9〕，并根據眼底病變嚴重程度分為A(增殖期視網膜病變33例)、B(背景期視網膜病變50例)、C(無視網膜病變組43例)3組。同期健康體檢者32例為對照組。受試者均簽署知情同意書。

1.2排除標準 1型糖尿病；由高血壓、機械性碰撞毆打等原因引起的視網膜病變；合并嚴重的肝、腎、心和肺功能障礙；合并惡性腫瘤。

1.3儀器和試劑盒 810半導體激光、視野檢查儀﹑日本拓普康非接觸眼壓儀﹑徳國ZEISS電腦驗光儀﹑角膜地形掃描儀﹑超大型聲波角膜測厚儀﹑角膜曲率計儀﹑裂隙燈檢查儀、日本佳能數字眼底照相機CX-I，AU2700全自動生化儀檢測。血糖和血脂試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Cys-C劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；尿肌酐試劑盒購自北京院子能科學研究院。

1.4Cys-C基因檢測 搜索GenBank的Cys-C基因啟動子序列，用Primer軟件設計引物，Cys-C基因+148、+73和-82位點引物序列見表1。聚合酶鏈反應(PCR)體系50 μl：混合反應液8 μl+含dNTP和Taq酶0.5 μl+DNA模版2 μl+上、下游引物各1 μl，用無菌水定容。Cys-C+148、+73和-82基因位點的擴增條件：94℃ 5 min預變性；94℃ 1 min，62℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸5 min。將酶切產物在瓊脂糖凝膠上點樣，凝膠圖像分析儀下觀察。

表1 Cys-C+148、+73和-82基因位點引物序列

1.5血糖和血脂 檢測所有受試者的空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)。

1.6其他指標 檢測所有受試者血壓和血清Cys-C。尿液ACR檢測取晨尿的中段尿，尿微量白蛋白采用放射免疫法檢測。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行χ2、F檢驗，Logistic多元回歸分析。

2 結 果

2.1各組一般情況及相關指標的比較 各組性別、年齡、體重指數和血壓差異無統計學意義(P>0.05)；病程、FBG、HbA1c、TC、Cys-C和ACR組間差異有統計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 各組一般情況及相關指標的比較

2.2各組Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平比較 各組Cys-C各基因分型差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。各組Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.3影響DR的Logistic分析 顯著影響DR的因素分別為病程、Cys-C、ACR和FBG(P<0.05)，HbA1c和TC對DR影響不顯著(P>0.05)，見表5。

表3 各組Cys-C各基因分型(n)

表4 各組Cys-C各基因型的Cys-C和ACR水平比較

表5 影響DR的Logistic分析結果

2.4Cys-C、ACR與DR相關性 Cys-C和ACR均與DR呈正相關(r=0.791，P=0.004；r=0.598，P=0.032)。

3 討 論

T2DM是一種內分泌代謝性疾病，可影響全身多個器官，與眼睛的關系更為密切，DR是T2DM最嚴重并發癥之一，DR可隨DM病程加長而嚴重〔10，11〕。

Cys-C是低分子量的減性非糖化蛋白質，在人體內穩定表達，不受年齡、性別和腫瘤病變等因素影響〔10〕。生理狀態下，Cys-C的功能在于抑制內源性半胱氨酸蛋白酶活性。近期研究顯示，Cys-C基因多態性可影響Cys-C外周血的表達及活性，原因在于Cys-C+73位點的A/G突變，可誘導信號肽在位點的丙氨酸被蘇氨酸所替代，Cys-C+148位點G/A突變，可誘導信號肽在位點的蘇氨酸為丙氨酸所替代，上述替代影響了Cys-C向內質網及高爾基復合體輸運，致使Cys-C分泌減少甚至活性降低〔12〕，但本課題結果顯示，Cys-C3個基因位點+148、+73和-82在正常人和T2DM患者的分布不存在差異，不同基因型的T2DM患者Cys-C無統計學差異，類似結果也可見相關文獻〔13〕。但對于檢出的外周血Cys-C活性是否降低難以確認，未檢出相關性是否與納入的患者例數較少，人群代表性還不夠強等受限因素相關，仍有待擴大樣本后驗證。Cys-C與T2DM的慢性并發癥相關，與基質金屬蛋白酶和組織蛋白酶協同參與T2DM的血管和神經病變過程〔14，15〕。

本課題結果提示Cys-C與DR關系密切，可能原因在于Cys-C可通過影響蛋白水解酶的活性及可抑制同型半胱氨酸的代謝，參與血管內皮細胞損傷、血管重塑、血管壁重構、血管新生及神經元退行性等病變過程相關，DR的病理具體表現為小動脈閉鎖，新生血管和纖維組織不可逆增生，并伴隨炎癥反應增強，致使血管和神經發生不可逆損害，視力降低及不可逆的失明，可見血清Cys-C和DR具有共同病變通路是兩者密切相關的病理基礎〔16～20〕。由此可見血清Cys-C水平可反映并預測T2DM視網膜神經病變的程度，可作為指示DR程度的危險因素，因此在T2DM確診后可檢測Cys-C，有利于及早防治或延緩DR的發生和發展。

高血糖是ACR升高的重要病因，持續的高血糖可使腎小球處于高濾過狀態，腎小球毛細血管通透性改變，毛細血管壁血漿蛋白沉積，使腎臟病變進行性發展。ACR越高，血糖的控制越差。DR的發生發展伴隨腎臟濾過功能與蛋白排泄異常，促使尿微量白蛋白明顯增加，尿肌酐相對降低，ACR增高，視網膜神經病變相關的氧化應激及炎癥可進一步增高尿微量白蛋白，進而增加ACR〔21～23〕。ACR檢測不僅方便快速，而且精確可靠，對于定性或定量DR可作為重要的參考指標。研究顯示外周血清Cys-C水平與FBG、HbA1c和TC呈正相關〔24〕，本文結果顯示，隨著DR嚴重程度增加，Cys-C水平明顯增加，FBG、HbA1c和TC也隨之升高。