混菌發酵對葡萄酒感官品質和風味物質的影響

許維娜，耿常樂，任同同，孔祥君

（1. 濱州醫學院藥學院葡萄酒學院，山東煙臺 264003；2. 煙臺張裕集團有限公司/山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001；3. 煙臺邁百瑞國際生物醫藥有限公司，山東煙臺 264006）

葡萄酒發酵過程中，酵母菌的種群組成及變化對葡萄酒的風味和品質有重要影響[1]。采用多種酵母菌混合發酵，不同于單一酵母菌發酵，能使發酵產品表現出更好的特性，如增加酒體的復雜度等[2]。混菌發酵過程中，各種酵母或者代謝產生一些有益的風味化合物如高級醇、酯類等，或者降解某些異味物質如乙酸、乙醛等，或者促進其他酵母的代謝性能，從而最終改變發酵產物的風味特征，使發酵出來的葡萄酒風味更佳豐富、濃郁[3-6]。綜合說來，混菌發酵并不是兩種微生物的簡單混合，在發酵中各菌種會產生明顯的互補增效作用，大大提高產品質量。目前，混菌發酵在葡萄酒行業普及程度低，具有極大的開發前景。

目前，葡萄酒混菌發酵的相關研究多采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與非釀酒酵母（non-Saccharomyces）混合發酵，如趙賓賓[7]采用釀酒酵母與淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）混合發酵，韓姍姍[8]采用釀酒酵母與檸檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）混合發酵，Moreira等[9-10]采用釀酒酵母與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）混合發酵。非釀酒酵母雖然發酵風味較好，但發酵產品也存在一些隱患，如食品安全問題等。

本研究選擇兩株釀酒酵母（速度型發酵菌株和風味型發酵菌株）進行混合發酵，考察不同接種比例對發酵產品感官特性和風味物質的影響，探索最適合的發酵比例，為葡萄酒發酵工藝的優化提供了一種有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

釀酒酵母S2，速度型發酵菌株，本實驗室2016年分離自大柳行葡萄基地；釀酒酵母F6，風味型發酵菌株，本實驗室2016年分離自大澤山某葡萄基地；釀酒葡萄‘蛇龍珠’取自煙臺蓬萊某葡萄園，除梗破碎后取汁。

1.2 主要試劑和設備

蛋白胨、酵母粉，英國OXFID公司；葡萄糖、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；斐林A液、斐林B液，無錫市亞泰聯合化工有限公司；3-辛醇、氬氣，山東天海有限公司。

Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計，安捷倫科技公司；臥式全溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；TSQ8000Evo氣相色譜-質譜聯用儀，美國Thermo公司；附溫度計密度瓶，上海壘固儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄酒酵母的活化與濃度測定

將釀酒酵母S2和F6接種到YEPD液體培養基中，于28℃，150 r/min振蕩培養24 h。按5%的接種量接種至葡萄汁液體培養基，相同條件下振蕩培養24 h，重復1次，得到活化的野生葡萄酒酵母。

活化后的酵母適度稀釋后，紫外分光光度法測量其吸光度值（OD600），計算酵母菌濃度，以此為依據計算接種量。計算公式：酵母菌濃度/(個/mL)＝OD600×稀釋倍數×107。

1.3.2 接種與發酵

共設7個試驗樣品，其中S2與F6的接種比例分別為6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6（樣品1～7），S2和F6單獨接種作為對照（樣品8、9）。24～26 ℃進行發酵。

發酵開始后，每天監測比重、溫度、CO2、失重量，重量、比重基本不發生變化時結束發酵。發酵液低溫澄清后進行倒罐，轉入新的發酵罐低溫儲藏。

1.3.3 葡萄酒的理化指標檢測

葡萄酒的總糖與還原糖測定采用斐林滴定法，總酸的測定用酸堿滴定法，酒精度的測定用密度瓶法[11]。

1.3.4 香氣成分檢測

利用頂空固相微萃取法進行香氣富集，氣相色譜-質譜法檢測香氣物質，參考李凱等[12]方法。取5 mL酒樣于萃取瓶中，加入轉子和1.5 g NaCl、200 μL 3-辛醇，50 ℃水浴預平衡10 min，將活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分萃取50 min，將進樣器插入進樣口10 min進行測樣。GC-MS法分析測得的香氣物質的峰面積及出現時間，通過對比3-辛醇的面積及濃度計算該香氣物質的濃度。色譜柱為CP-WAX57CB，進樣量10 μL，色譜條件是載氣流速0.8 mL/min，空氣流速300 mL/min，分流比30∶1，進樣口溫度250 ℃。

1.3.5 感官評價

參照GB/T 15038—2006[13]中香氣評價方法，由15位品酒員組成感官評價小組，對不同比例的酵母釀造的葡萄酒分別從外觀（20分，包括澄清度及掛杯性10分、色澤10分）、香氣（40分，包括風味特征20分、協調性20分）、口感（40分，包括口感特性20分、協調性20分）三個方面進行感官評價。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

如表1所示。所有樣品的殘糖都在4 g/L以下，酒精度在11.04～12.89 %vol，總酸在4.01～4.25 g/L。混菌發酵樣品普遍糖含量較低，糖利用程度較高。S2單獨發酵的樣品酒精度最高，其糖耗主要進行酒精發酵；F6單獨發酵的樣品酒精度最低；混菌發酵樣品的酒精度介于兩者之間。

表1 發酵樣品理化指標Table 1 Physicochemical indexes of fermented samples

2.2 香氣物質檢測結果

通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜方法對葡萄酒香氣成分進行分析，共檢測出56種香氣成分，按照結構特性將56種香氣物質分為酯類（表2）、醇類（表3）、酸類（表4）、羰基化合物（表5）、萜烯醇類（表6）六大類。從表中可以看出，不同比例接種的酒樣所含的香氣物質不同，香氣物質中以醇類和酯類物質為主，酯類種類最多，醇類和酸類次之，羰基化合物、萜烯醇類在總含量中所占比例很小。

如表2所示，各樣品中共鑒定出酯類香氣物質24種，其中單菌發酵的酒樣中擁有21種，表明混菌發酵過程中，不同菌株互相激發和促進，產生了更多的香氣物質。酯類中，辛酸乙酯含量最高，濃度在3.4～4.6 g/L，其他酯類香氣癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯和十六酸乙酯相對含量也較高，這些酯類在葡萄酒中主要貢獻的香氣類型是蘋果、草莓等果香。酯類物質含量最高的為樣品9（風味型菌株F6單獨發酵），其次為樣品6（S2∶F6=1∶4）。

如表3所示，各樣品中共鑒定出醇類香氣物質12種，其中除了乙醇含量最多外，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇和己醇所占比例也較高。醇類物質呈現的除了酒精獨特的香味外，還有青草味、玫瑰花香、香料、苦杏仁味等，貢獻的主要是植物類香氣。醇類物質含量最高的樣品為樣品8（速度型菌株S2單獨發酵），而且速度發酵菌株比例較高的樣品中，醇類物質含量也較高。

如表4所示，酸類中含量較高的有辛酸、正癸酸、乙酸和癸烯酸。辛酸是一種低級脂肪酸，它具有干酪味和粗獷味。然而，它在整個酒結構中起著重要的作用，并能抑制芳香酯的水解，因此對于香氣平衡具有重要作用。高含量（大于20 mg/L）的C8～C10脂肪酸會表現不良風味，然而低含量可以帶來令人愉悅的氣味[14-15]。本研究中辛酸的濃度范圍為1.32～1.70 mg/L，會對整體香氣產生良好的影響。酸中其他物質呈現為不愉悅的香氣如腐敗味、醋味、黃楊木味等，但含量相對較低，對香氣影響較小。

如表5所示，羰基化合物中的大馬酮含量相對較高，它具有強烈干果香氣，增強了葡萄酒的特征香氣[16]。樣品9中羰基化合物含量最高。

如表6所示，萜烯醇類物質中的里哪醇和橙花醇、橙花叔醇香氣突出，它們主要來源于葡萄果實，在葡萄酒的發酵和儲藏過程中很少或不發生改變，是形成品種香氣的重要化合物[17-20]。樣品6中萜烯醇類物質含量最高。

2.3 感官品評結果

表2 酒樣中脂類物質含量 （單位：g/L）Table 2 Contents of esters in wine samples (Unit: g/L)

表3 酒樣中醇類物質含量 （單位：g/L）Table 3 Contents of alcohols in wine samples (Unit: g/L)

表4 酒樣中酸類物質含量 （單位：g/L）Table 4 Contents of acids in wine samples (Unit: g/L)

表5 酒樣中羰基化合物含量 （單位：g/L）Table 5 Contents of carbonyl compounds in wine samples (Unit: g/L)

表6 酒樣中萜烯醇類化合物含量 （單位：g/L）Table 6 Contents of terpene alcohols in wine samples (Unit: g/L)

將15名品評員的品評數據進行統計，結果如圖1所示。樣品6（S2∶F6＝1∶4）得分最高，表現為較明顯的果香和發酵香，香氣平衡，酒體豐滿。相對而言，速度發酵菌株比例較大的樣品中，奶酪、肥皂的氣味較濃，香氣和口感不佳，這主要是因為酵母發酵使二類香氣比例變大，掩蓋了一類香氣，從而降低了葡萄酒的質量。

綜合香氣物質分析和感官品評結果，認為樣品6為最佳樣品，即速度發酵酵母與風味發酵酵母接種比例為1：4時酒的質量最好。

3 結論

本研究將速度發酵酵母與風味發酵酵母按照不同的比例接種到‘蛇龍珠’葡萄汁中進行發酵，發酵結束后，對發酵液進行理化指標和香氣物質檢測，并進行感官品評，探索混合發酵中接種比例對葡萄酒質量的影響。

研究結果表明，單一菌株發酵的葡萄酒有明顯的果香但香氣較為單一，有些香氣物質相較于混菌發酵來說含量較少甚至沒有，混合發酵對于葡萄酒香氣復雜度的提升有重要意義。速度發酵菌和風味發酵菌的接種比例為1∶4時釀造的葡萄酒風味最好，發酵產品呈現出明顯的品種香氣和清新的果香和淡花香。相對比例較高的風味型酵母會使葡萄酒在發酵過程中形成的發酵香氣更為復雜、濃郁，但如果風味型酵母的比例過高，則會使發酵香氣掩蓋一類香氣，使葡萄酒整體呈現奶酪味、肥皂味等不良氣味，因此過于追求發酵類香氣并不能使葡萄酒的氣味更加豐富，而會導致整體酒香失衡從而使葡萄酒質量變差。

本研究探索了接種不同比例的兩種釀酒酵母對葡萄酒質量的影響，后期可以在不同比例的基礎上，嘗試進行順序發酵，繼續優化混菌發酵工藝，利用混菌發酵釀造更具風味的優質葡萄酒。

圖1 感官分析雷達圖Figure 1 Radar map of sensory analysis