阪崎腸桿菌在不同品牌顯色培養基上的對比分析

李 翠，周志云，楊 靜，楊曉莉

(陜西省食品藥品監督檢驗研究院，西安 710065)

本文按照國家標準[1-7]根據阪崎腸桿菌在分離平板的菌落形態，選擇不同生產單位的分離培養基進行分離培養，對市售的不同生產單位的阪崎顯色培養基(DFI)進行對比，評判不同生產單位培養基的選擇性強弱，為生產企業及相關檢驗機構對培養基供應商的選擇提供依據，為食品標準中阪崎腸桿菌檢驗培養基的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗用菌株 阪崎腸桿菌(ATCC 29544-3)，批號：20160613，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.1.2儀器材料 LRH-250F生化培養箱，重慶萬達實驗儀器廠生產；WP-600恒水式電熱恒溫培養箱，重慶萬達實驗儀器廠生產；LRH-250F生化培養箱，廣東省醫療器械廠生產；CC型BagSystem樣品均質器系統，法國interscience生產；全自動微生物生化鑒定系統VITEK2 Compact 30，法國梅里埃有限公司生產；革蘭氏陰性細菌鑒定卡 (VITEK 2 GN Test Kit )，美國Biomer teux inc生產。

1.1.3培養基 試驗中使用的培養基信息見表1。

1.1.4樣品 奶粉，2017年國家食藥總局盲樣考核，規格100g/袋，樣品編號CODE1～CODE10；菌株，國家食藥總局盲樣考核，規格1株/支，樣品編號CODE1～CODE10。

表1 試驗中使用的培養基信息

注：編號A、B、C、D、E分別為不同生產單位的不同品牌的阪崎腸桿菌顯色培養基

1.2 方法

1.2.1前增菌和增菌 取奶粉100g和菌株1支從CODE1～CODE10分別加入已預熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的均質袋中，用均質器均質1min，使樣品充分溶解，置36℃培養18h。分別移取上述增菌液1mL轉種于10mL mLST-Vm肉湯，置44℃培養24h。

1.2.2分離 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養物，各取增菌培養物1環，分別劃線接種于5個生產單位各2個阪崎腸桿菌顯色培養基平板，36℃培養24h。從每個阪崎顯色培養基平板上分別挑取5個可疑菌落，不足5個的全部挑取，劃線接種于TSA平板，25℃培養48h。 自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行生化鑒定，并用VITEK 2全自動微生物生化鑒定系統進行確認。

2 結果與分析

與其他腸桿菌不同，阪崎腸桿菌獨有a-葡萄糖苷酸酶。阪崎腸桿菌顯色瓊脂含有a-葡萄糖苷酸酶底物，當被阪崎腸桿菌水解時形成藍綠色的陽性菌落。陽性菌株在所有生產單位生產的DFI上均顯示為藍綠色菌落。上述10個樣本在A單位的DFI平板上，CODE2、CODE7有藍綠色菌落生長，其余8個樣本在DFI平板上均為褐色菌落；在B單位的DFI平板上除CODE5無菌落生長外，其余9個樣本在DFI平板上均有藍綠色菌落生長；在C單位的DFI平板上CODE2、CODE6、CODE7有藍綠色菌落生長，CODE5無菌落生長，其余樣本為白色菌落、白色中心黑色菌落；在D單位的DFI平板上，CODE2、CODE3、CODE4、CODE6、CODE7、CODE8、CODE10有藍綠色菌落生長，CODE5和CODE9均為淺紫色菌落；在E單位的DFI平板上，CODE2、CODE7有藍綠色菌落生長，其余8個樣本在DFI平板上均為褐色菌落(表2)。

表3顯示，對A單位DFI平板上的藍綠色菌落進行鑒定，從CODE2平板上挑取的5個菌落和從CODE7平板上挑取的5個菌落均確認為阪崎腸桿菌。對B單位DFI平板上的藍綠色菌落進行鑒定，CODE2平板上挑取的5個菌落中有3個確認為阪崎腸桿菌，其余2個菌落確認為奇異變形桿菌；CODE7平板上挑取的5個菌落中有3個確認有阪崎腸桿菌，其余2個菌落確認為奇異變形桿菌，CODE1、CODE3、CODE4、CODE8、CODE9、CODE10上分別挑取的5個菌落均確認為奇異變形桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認為弗勞地檸檬酸桿菌。對C單位DFI平板上的藍綠色菌落進行鑒定，CODE2和CODE7平板上挑取的5個菌落均確認為阪崎腸桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認為弗勞地檸檬酸桿菌。對D單位DFI平板上的藍綠色菌落進行鑒定，CODE2上挑取的5個菌落均確認為阪崎腸桿菌；CODE7上挑取的5個菌落中有2個菌落確認為阪崎腸桿菌，其余3個確認為奇異變形桿菌；CODE1、CODE3、CODE4、CODE8、CODE10上分別挑取的5個菌落均確認為奇異變形桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認為弗勞地檸檬酸桿菌。對E單位DFI平板上的藍綠色菌落進行鑒定，從CODE2平板上挑取的5個菌落和從CODE7平板上挑取的5個菌落均確認為阪崎腸桿菌。

表2 樣品在DFI平板上的菌落形態

(續)

表3 各疑似菌落VITEK 2鑒定結果

備注：“/”表示顯色平板未見疑似，未進行確認試驗；“+”表示檢出阪崎腸桿菌；“-”表示未檢出阪崎腸桿菌

表4顯示，A和E單位的DFI選擇性明顯優于其他3個單位的顯色培養基，10份樣本中有2個樣本在顯色培養基上有疑似菌落生長，從2個樣本中挑取10個疑似菌落經純化、鑒定確證為阪崎腸桿菌，陽性準確率達到100%，假陽性菌落數為0；C單位的DFI選擇性次之，10個樣本中有3個樣本在顯色培養基上有疑似菌落生長，從3個樣本中挑取15個疑似菌落經純化、鑒定確證10個疑似菌落為阪崎腸桿菌，陽性準確率為66.67%，假陽性菌落數為5；D單位的DFI和B單位的DFI選擇性最低，10份樣本中分別有7個樣本和9個樣本在顯色培養基上有疑似菌落生長，分別挑取35個疑似菌落和45個疑似菌落經純化、鑒定確證為阪崎腸桿菌的菌落數分別為7和6，假陽性菌落數分別為22和39，準確率僅為20.00%和13.33%。

表4 各生產單位顯色培養基選擇性對比結果

3 討論

本實驗中E單位和A單位生產的DFI培養基具有較好的選擇性，準確率均達到100%，且在平板上生長的菌落形態比較典型，在阪崎腸桿菌檢查時，可首選此2個生產單位的顯色培養基進行實驗。顯色培養基也存在一定的缺陷，由于某些腸道細菌也會含有與阪崎腸桿菌相同的α-D-葡萄糖苷酶，或奶粉在生產加工的過程中添加的有機或無機成分種類多且復雜，影響了酶與底物的反應，在沒有高效的前增菌條件下，會出現假陽性和假陰性現象，從而干擾目標菌的檢測。這些缺陷可以通過改變增菌培養條件等方法彌補而取得良好的分離、鑒定效果[8]。進行阪崎腸桿菌的檢查時，在樣品的前增菌和增菌培養中要嚴格按照標準操作，樣品要加入到預熱至44℃的緩沖蛋白胨水充分溶解，轉種的mLST-Vm肉湯要臨用新制，保證在24h內使用，使樣品中可能污染的微生物充分復蘇，以得到更加科學、準確地實驗結果，確保食品的安全、可靠。B單位和D單位生產的DFI培養基選擇性低，假陽性樣本數分別為5和7，準確率分別為13.33%、20.00%，假陽性樣本數較多，在顯色培養基分離中不能快速、有效、準確的篩選出目標菌，使整個實驗變得復雜，增加工作量。對于沒有生化鑒定系統，需要通過顯色培養基篩選結果判定的單位，可能會造成誤判。建議必須通過API、VITEK、PCR等鑒定后才可以下結論。對同種培養基不同生產單位的對比較少[9-13]，而不同生產單位的同種培養基的選擇性、準確率差異較大，因此，建議各單位在參加盲樣考核、能力驗證、比對試驗時盡量選擇不同生產單位的增菌培養基或選擇性分離培養基，避免因培養基的質量差異而出現檢驗結果的錯判。同時，嚴格按照國標[14]進行培養基的驗收檢查。◇