新生豬缺氧缺血性腦損傷后基底節區Tau蛋白與谷氨酸變化的相關研究

鄭 陽，王曉明

（中國醫科大學附屬盛京醫院放射科，遼寧 沈陽 110004）

微管是腦內的細胞骨架成分，主要由微管蛋白及微管相關蛋白組成，微管影響腦組織細胞多種功能。Tau蛋白是腦內含量最多的微管相關蛋白，神經系統內主要在少突膠質細胞中廣泛表達。腦組織內Tau蛋白的作用主要是與微管蛋白結合，促進微管形成，同時能夠維持微管的穩定性[1]。Tau蛋白異常磷酸化可導致其喪失正常的生理功能，異常過度磷酸化后與微管蛋白的結合能力僅是正常蛋白結合能力的1/10，失去維持微管穩定性的作用，致使受累微管結構破壞，正常軸突轉運障礙[2]。Wen等證實[3]缺氧缺血（Hypoxic ischemia，HI）后，神經元中 Tau蛋白過度磷酸化與細胞凋亡關系密切。由于谷氨酸（Glutamate，Glu）是腦內含量較多的興奮性氨基酸，參與腦內能量代謝的調節，本研究采用新生豬HI模型研究HI后腦組織內Tau蛋白及Glu的變化，揭示HI后Tau蛋白及Glu變化的相關性。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

選用新生約克夏豬45只，3～5 d日齡，體質量1～1．5 kg，性別雄性（為盡量減少性別帶來的個體差異）。所有動物模型制備過程執行《實驗動物管理條例》和《實驗動物許可證管理辦法》規定的標準。隨機分配到對照組（n=9）及模型組（n=36）。模型組根據HI后MR掃描時間段又進一步分成6個亞組（0～2 h，n=4；2～6 h，n=5；6～12 h，n=6；12～24 h，n=5；24～48 h，n=7；48～72h，n=9）。 本研究獲得中國醫科大學動物實驗倫理委員會批準（倫理批號為：2015PS337K）。

1．2 實驗模型制作

1．2．1 對照組

室溫保持在28～30℃，臀部肌肉注射速眠新（0．6 mL/kg）麻醉新生豬。麻醉過程中密切觀察動物的生命體征，一旦發現動物陷入昏迷并且伴有肌肉松弛、四肢肌張力減低及角膜反射遲鈍，立即將新生豬以仰臥位固定在操作臺上實施手術。首先，在喉鏡引導下對新生豬實施氣管插管 （φ2．5 mm），連接TKR－200C小動物呼吸機進行機械通氣，通入100%氧氣，呼吸機通氣參數值被設置為呼吸比 （1/E）1∶1．5，呼吸頻率30次/min。應用 TuffSat手掌式脈搏血氧儀（美國GE公司）監測心率和血氧飽和度。在對切口部位及周圍皮膚進行消毒后，頸正中切口，將雙側頸總動脈及毗鄰的頸內靜脈與迷走神經分離開來，留置5．0 mm絲線。對照組僅進行手術，不進行HI過程。

1．2．2 HI模型組

模型組新生豬進行上述相同過程，待動物狀態穩定30 min后，用小動脈夾夾閉雙側頸總動脈，阻斷雙側頸動脈血流，同時機械通入6%含氧混合氣，持續40 min。然后停止HI過程，撤去動脈夾，恢復雙側頸動脈血流，重新機械通入100%氧氣，縫合切口。建模過程中注意對新生豬生命狀態進行監控。同時若術中及術后發生休克及抽搐應及時處理[4－5]。術后，將動物轉移至恒溫箱（37℃）內，以保持術后恢復期間動物體溫維持在正常范圍內。自主呼吸恢復后停用呼吸機。注意在MR掃描時應保持體溫，避免溫度波動給實驗結果帶來偏差。MR成像時對未恢復自主呼吸的采用人工抱球法維持呼吸[4，6－7]。

1．3 1H－MRS 掃描及數據處理

采 用 Philips 3．0T MRI （Achieva 3．0T TX；Philips Healthcare Systems，Best，the Netherlands）進行掃描，筆形束，二階勻場。體線圈發射，八通道頭線圈（Sense）接收。MRS采用單體素長TE掃描：TR/TE=2 000 ms/144 ms，NSA=64，VOI=10 mm×10 mm×10 mm。 感興趣區（Regions of interest，ROI）選擇右側基底節（圖1）。每只新生豬在HI后按分組中規定的各時間點進行MR掃描。掃描獲得的波譜數據通過 （Linear combination of Model in vitro spectra,LcModel）進行后處理（NAA 位于 2．02 ppm，Cr位于3．02 ppm，Cho 位于 3．2 ppm，Lac 位于 1．33 ppm，Tau包含兩組波峰，分別位于3．25ppm及3．42ppm附近）。

圖1 1H－MRS成像ROI的定義。采用T2WI圖像橫斷位進行ROI選擇，右側基底節區作為1H－MRS ROI。Figure 1. Definition of ROIs in 1H－MRS．Illustration of the ROI in MRS scanning．For all animals,the right basal ganglion is selected as the ROI(T2WI image served as reference for the selection of ROIs in this study)．

1．4 統計分析

采用SPSS軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示。采用ANOVA方差分析比較對照組及HI模型組各個時間點的基底節區Tau蛋白含量及Glu含量的表達是否存在統計學差異；采用Spearman相關分析對Tau蛋白含量及Glu含量進行相關性分析，其中P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 基底節區Tau蛋白含量

HI再灌注后，各時間點Tau蛋白含量均值呈現先升高后降低的趨勢，在24～48 h達到最高值，均值在48～72 h隨時間稍有下降（圖2）。除0～2 h組Tau蛋白含量與對照組無統計學差異外（P=0．243），其余各組與對照組比較均有統計學差異 （P＜0．05）。Tau蛋白含量最高點24～48 h組除與48～72 h無統計學差異外，與對照組及模型組其余各時間點均有統計學差異（P＜0．05）。

圖2 對照組及模型組基底節區Tau蛋白表達隨時間變化趨勢。Figure 2. Tau content changes in basal ganglia within control group and HI group．

對照組及HI模型組部分時間點1H－MRS掃描數據經Lcmodel擬合曲線如圖3所示。

2．2 基底節區Glu含量

HI再灌注后，Glu含量呈現先上升后降低的趨勢，繼而又上升，即“雙峰”樣變化，在 6～12 h、24～48 h達到峰值后的12～24 h及48～72 h隨時間稍有下降（圖 4）。 6～12 h、24～48 h 兩次峰值與對照組均存在統計學差異（P＜0．05）。模型組中各時間點Glu含量與對照組比較均有統計學差異（P＜0．05）。

2．3 HI后基底節區Tau與Glu變化的相關性

HI后，基底節區Tau蛋白含量與Glu含量隨時間變化成正相關，相關系數為 0．76（P=0．00）（圖 5）。

圖3 對照組及模型組部分時間點內Tau蛋白1H－MRS（經LcModel軟件處理）結果。圖3a～3d分別為對照組及HI后16 h、35 h、68 h右側基底節1H－MRS的譜線（圈內所示為Tau峰，位于3．25 ppm及3．42 ppm附近）。HI后16 h、35 h Tau峰升高，68 h可見Tau峰稍下降。Tau蛋白含量分別為 0 mmol/kg、0．68 mmol/kg、2．58 mmol/kg、1．997 mmol/kg。Figure 3. Results of Tau content and1H－MRS data at selected time points sample data analyzed by LCModel in control and study group．Figures 3a～3d are the1H－MRS spectral curves of the right basal ganglion analyzed by LCModel in the control group and the HI group at 16 h,35 h and 68 h,respectively．At 16 h and 35 h after HI insult,the Tau peaks(3．25 ppm,3．42 ppm)are markedly elevated;at 68 h,the Tau peak is lower than 35 h group．Tau concentration are 0 mmol/kg,0．68 mmol/kg,2．58 mmol/kg,1．997 mmol/kg respectively．

3 討論

新生兒出生后腦組織發育主要包括神經細胞的增殖及髓鞘形成。Kreis等[8]發現，不同孕齡正常新生兒腦內不同部位Tau含量不同，同時Huppi等[9]也證實足月兒及早產兒腦內Tau蛋白水平不同，但是二者Tau蛋白的含量均隨著年齡增長逐漸上升至成人水平。

圖4 對照組及HI模型組基底節區Glu含量隨時間變化趨勢（橫線表示均值）。在HI后Glu首先出現上升，于6～12 h及24～48 h兩次達到高峰，繼而逐漸下降。Figure 4. Glu changes in basal ganglia within control group and HIBI group．The Glu peak increases 6～12 h,24～48 h after HI．The level of Glu gradually decreased．

圖5 HI后Tau含量與Glu含量變化的相關性。圖5a為Tau蛋白含量與Glu含量在HI后不同時間段內隨時間變化的趨勢（各點表示均值；左側Y軸及黃線表示Tau含量，右側Y軸及粉線表示Glu含量）；圖5b為HI后Tau蛋白含量與Glu呈線性正相關，Spearman 相關系數為 0．76。Figure 5.Correlation of changes in content of Tau and Glu after HI．Figure 5a:The mean value of time varying between Tau and Glu in different time periods after HI(Each point represents the mean value．The left Y－axis and yellow line indicate the content of Tau,and the right Y－axis and pink line indicate Glu content)．Figure 5b:After HI,there is a positive linear correlation between Tau and Glu,and the correlation coefficient of Spearman is 0．76．

Glu為腦內含量較多的興奮性神經遞質，在突觸信號傳遞過程中發揮著重要作用[10－12]。生理情況下，Glu參與調控發育腦中少突膠質細胞前體細胞的形態分化，是髓鞘發育的必要條件[13]。Tau蛋白是腦內含量最多的微管相關蛋白（Microtubule－associated proteins，MAPs），生理功能是促進微管形成及穩定微管[14－15]。Tau蛋白含量的病理性表達及異常磷酸化是HI后影響髓鞘化的重要因素。

研究證實，Glu代謝障礙可導致Tau蛋白出現異常過度磷酸化及神經毒作用[16－18]。由于HI后，小膠質細胞釋放大量Glu，并激活少突膠質細胞前體細胞上的海人藻酸受體（KAR）和α－氨基－3羥基－5甲基－4異惡唑受體（AMPARS），介導少突膠質細胞前體細胞內Ca2+超載，此外，還可以激活星形膠質細胞上的 N－甲基－D－天門冬氨酸（N－methyl－d－aspartic acid receptor，NMDAR），使臨近的少突膠質細胞由NMDAR介導的興奮性Ca2+通路激活，導致Ca2+超載，介導少突膠質細胞壞死，Glu的興奮性毒作用是少突膠質細胞及少突膠質細胞前體細胞死亡的重要機制[19－20]。在HI條件下，無氧酵解可引起乳酸中毒，這種缺氧狀態會直接導致神經元壞死[21]。神經元損傷后，Tau蛋白可從神經元胞體釋放，可從微管上脫落，因此，受損細胞數量越多、損傷程度越重，Tau蛋白釋放就越多，游離的Tau蛋白也越多，引起腦組織中 Tau蛋白含量升高[22－23]，由此可見，Tau蛋白含量可反映神經系統的損傷程度。

通過本研究結果可見，HI后，Glu及Tau蛋白均呈現先增高后降低的趨勢，Glu及Tau蛋白呈顯著正相關（r=0．76）。HI后，Glu 濃度升高，Tau 蛋白釋放增加，Glu與Tau蛋白具有共同作用，過度磷酸化的Tau蛋白可引起線粒體功能障礙，同時可引起興奮性氨基酸轉運體功能受損，Glu在突觸部位的清除能力降低并逆向轉運，導致細胞外Glu大量聚集。

有研究表明，HI大鼠腦內皮質和腦室周圍白質的神經細胞凋亡數量與Tau蛋白表達水平呈正相關[24]，其可能的機制是HI后神經細胞死亡釋放了Tau蛋白所致。而微管結構的破壞會導致神經元細胞體與神經纖維之間的物質傳遞障礙，從而造成神經細胞的壞死與凋亡及神經纖維的變性。

本研究中，HI后12～24 h，Glu濃度有個短暫的低峰，這是因為此時負責將胞外Glu重新攝取回到星形膠質細胞胞內的谷氨酸轉運體的作用，將多余的 Glu 轉化為谷氨酰胺（Gln），并通過“Glu（in neuron）－Gln（in astrocyte）”循環返回神經元[25]，繼而又升高可能是由于再灌注損傷引起細胞破裂導致Glu釋放增加所致[26]。

本研究發現Tau蛋白升高后繼而稍微降低，與Franz等[27]觀察到的腦損傷后Tau蛋白先升高后降低的趨勢相似，這可能是由于長時間HI，導致腦組織細胞死亡數量增加，Tau合成減少以及分解增加所致。

本研究選擇基底節作為ROI，采用1H－MRS成像結合Lcmodel軟件處理，分析HI后Tau蛋白含量及Glu含量的變化的相關性，發現二者的變化呈正相關，HI后共同調節腦內病理生理變化，分析了HI再灌注后神經網絡的調節機制，為進一步研究打下基礎。