細針穿刺標本Midkine檢測在甲狀腺微小乳頭狀癌中的臨床意義

黃東航 陳旭 陳興

[摘要]目的 探討細針穿刺標本Midkine檢測在甲狀腺微小乳頭狀癌中的臨床意義。方法 選取2014年8月～2017年5月我院收治的50例甲狀腺微小乳頭狀癌患者、30例結節(jié)性甲狀腺腫患者的術中細針穿刺標本作為研究對象，觀察兩類病理類型免疫細胞化學技術檢測Midkine的表達。結果 甲狀腺微小乳頭狀癌細針穿刺標本Midkine的表達明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫，差異有統計學意義（P<0.01）。有淋巴結轉移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細針穿刺標本Midkine表達陽性率高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 檢測細針穿刺標本Midkine的表達可為甲狀腺微小乳頭狀癌的正確診斷和淋巴結轉移預測提供幫助。

[關鍵詞]中期生長因子；甲狀腺癌；腫瘤標志物；免疫細胞化學

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）7（c）-0117-03

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of fine-needle aspiration specimen Midkine detection in papillary thyroid microcarcinoma. Methods Fine-needle aspiration specimens from 50 patients with papillary thyroid microcarcinoma and 30 patients with thyroid nodular goiter who were admitted to our hospital and underwent surgery from August 2014 to May 2017 were selected as objects. Immunocytochemical expression of Midkine was observed in fine-needle aspiration specimens from above patients. Results Fine-needle aspiration specimen Midkine expression of papillary thyroid microcarcinoma was significantly higher than that of thyroid nodular goiter， and the difference was statistically significant （P<0.01）. The positive rate of Midkine expression in patients with lymph node metastasis of papillary thyroid microcarcinoma was higher than that of patients without lymph node metastasis， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The detection of fine-needle aspiration specimen Midkine is helpful in the diagnosis of papillary thyroid microcarcinoma and the prediction of lymph node metastasis.

[Key words] Midkine； Thyroid carcinoma； Tumor marker； Immunocytochemistry

甲狀腺乳頭狀癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來不斷升高，其中大部分是微小乳頭狀癌[1-3]。甲狀腺微小乳頭狀癌是指腫瘤長徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀癌，預后通常較好，但是也有部分病例具有高侵襲性[4-6]。因其體積較小，常伴發(fā)結節(jié)性甲狀腺腫，極易被漏診或誤診。細針穿刺活檢是目前術前診斷甲狀腺乳頭狀癌最有效準確的方法[7-9]，但由于細針穿刺所獲標本量有限，不能反映病變全貌，約20%的結節(jié)仍難以準確定性[10-11]。因此，尋找能夠幫助診斷甲狀腺微小乳頭狀癌的分子標志物十分必要。有研究表明，甲狀腺乳頭狀癌組織標本的Midkine（中期生長因子）表達水平明顯高于甲狀腺良性病變[12-13]。本研究在甲狀腺微小乳頭狀癌的細針穿刺細胞學標本中，應用免疫細胞化學方法進行Midkine檢測，探討其對甲狀腺微小乳頭狀癌鑒別診斷的應用價值及與臨床病理因素的相關性，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年8月～2017年5月我院收治的50例甲狀腺微小乳頭狀癌患者、30例結節(jié)性甲狀腺腫患者的術中細針穿刺標本作為研究對象。患者術后均經病理組織學檢查確診。甲狀腺微小乳頭狀癌組患者中，男14例，女36例；年齡22～67歲，平均（48±7）歲。結節(jié)性甲狀腺腫組患者中，男9例，女21例；年齡25～59歲，平均（46±8）歲。甲狀腺微小乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有患者均知曉本研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 用22 G針頭接10 ml一次性注射器，在甲狀腺結節(jié)中多點、反復負壓抽吸3～5次，將抽出物直接均勻涂于3～8張多聚賴氨酸處理過的玻片上。玻片置于95%酒精中固定15 min，然后放入保濕密閉的切片盒中，置于-20℃冰箱中冷凍保存待用。

1.2.2免疫細胞化學試劑 兔抗人Midkine抗體購自北京北方生物技術研究所有限公司；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒（PV9001）及二氨基聯苯胺顯色液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木素購自江蘇凱基生物技術有限公司。

1.2.3免疫細胞化學實驗方法 于冰箱中取出細胞涂片，置室溫10～15 min復溫。經蒸餾水洗滌后，在檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中抗原熱修復20 min。3%過氧化氫室溫孵育10～20 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加牛血清白蛋白封閉，室溫孵育20 min。滴加100倍稀釋的一抗兔抗人Midkine抗體4℃過夜，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。置于37℃水浴鍋內復溫45 min。滴加反應增強液，37℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。二氨基聯苯胺顯色5 min，雙蒸水沖洗。蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3評價標準

以細胞胞質內有清晰棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞占比≥10%的標本判定為陽性，反之，判定為陰性。

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1甲狀腺微小乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫患者細針穿刺標本Midkine表達陽性率的比較

甲狀腺微小乳頭狀癌細針穿刺標本Midkine的表達陽性率明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫，差異有統計學意義（P<0.01）（表1）。

2.2不同臨床病理特征甲狀腺微小乳頭狀癌患者細針穿刺標本Midkine表達陽性率的比較

不同性別、年齡、被膜有/無侵犯甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細針穿刺標本Midkine表達陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。無淋巴結轉移甲狀腺微小乳頭狀癌患者21例，Midkine陽性表達14例（66.7%）；有淋巴結轉移甲狀腺微小乳頭狀癌患者29例，Midkine陽性表達27例（93.1%），有淋巴結轉移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細針穿刺標本Midkine表達陽性率高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

目前術前診斷甲狀腺微小乳頭狀癌最有效準確的方法是細針穿刺活檢。由于細針穿刺活檢獲得的細胞學標本中組織形態(tài)與細胞間質結構大部分喪失，病理醫(yī)師進行診斷時主要依賴于對細胞，主要是其細胞核形態(tài)特征性改變的識別，如核膜不規(guī)則、核溝、核內假包涵體、毛玻璃樣核及砂礫體形成等，但不少甲狀腺微小乳頭狀癌并不具備這些典型特征。許多良性腫瘤病變及非腫瘤病變也可有核溝、毛玻璃樣核等改變。特別是甲狀腺微小乳頭狀癌結節(jié)小，穿刺獲得的標本細胞含量往往少，常常僅含有少量的腫瘤細胞，診斷和鑒別診斷更成困難[14]。為提高甲狀腺癌術前診斷的準確性，目前進行了大量關于甲狀腺癌分子標志物的研究[15]。

Midkine又稱中期生長因子，最初在視磺酸誘導分化的早期胚胎瘤細胞中發(fā)現。Midkine在妊娠中期胚胎組織大量表達，分布廣泛，之后逐漸減少，成年后只在少數組織中可檢測出。Midkine具有多種生物學活性，可以促進細胞生長、有絲分裂及細胞分化，增強纖維溶酶活性，促進神經元生長等[16]。近年已有研究發(fā)現，Midkine在多種腫瘤組織中過度表達，不僅能促進腫瘤細胞的生長，具有對抗腫瘤細胞凋亡的作用，影響腫瘤細胞的存活、增殖與分化，還可參與腫瘤的血管生成，直接參與腫瘤的生長、轉移過程[17]。Maeda等[18]發(fā)現，Midkine在胰頭癌組織中的表達陽性率為53.3%，Midkine表達陽性的患者5年生存率低于表達陰性的患者，多變量分析表明Midkine表達是胰頭癌預后的獨立預測因子。Zhao等[19]報道，Midkine在胃癌組織中呈過表達，而且其表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移相關，Midkine表達陰性的胃癌患者5年生存率高于表達陽性的患者。Jham等[20]研究表明，Midkine在口腔鱗狀細胞癌中的表達增加，并和腫瘤分期密切相關，在晚期口腔鱗狀細胞癌中表達更高。

本研究通過免疫細胞化學方法檢測甲狀腺微小乳頭狀癌、結節(jié)性甲狀腺腫患者細針穿刺標本中Midkine的表達，結果提示，甲狀腺微小乳頭狀癌細針穿刺標本Midkine的表達陽性率明顯高于結節(jié)性甲狀腺腫，差異有統計學意義（P<0.01），提示細針穿刺標本Midkine的檢測可為甲狀腺微小乳頭狀癌的正確診斷提供參考。接著按照多種臨床病理參數進行分層分析，研究結果提示，有淋巴結轉移甲狀腺微小乳頭狀癌患者的細針穿刺標本Midkine表達陽性率高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P<0.05），提示甲狀腺微小乳頭狀癌細針穿刺標本中Midkine的表達與頸部淋巴結轉移相關，細針穿刺標本Midkine的檢測可為甲狀腺微小乳頭狀癌淋巴結轉移的預測進而為治療決策的制定提供幫助。但本研究樣本較少，有必要進行更大樣本的研究。

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（收稿日期：2018-03-15 本文編輯：孟慶卿）