青藤堿對兔膝骨關節炎模型軟骨Toll樣受體2、4及髓樣分化因子88表達的影響

鄭潔 趙莉平 胡亞莉

摘要：目的 觀察不同劑量青藤堿對兔膝骨關節炎模型關節軟骨中Toll樣受體（TLR）2、4和髓樣分化因子88（MyD88）表達的影響，探討其相關作用機制。方法 采用Hulth法建立膝骨關節炎模型。實驗兔隨機分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，空白組不予任何處理，模型組和青藤堿低、中、高劑量組膝關節腔分別注射生理鹽水和0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg）青藤堿，共干預10次。實時熒光定量PCR和Western blot檢測關節軟骨TLR2、TLR4和MyD88的mRNA和蛋白表達。結果 模型組TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達較空白組均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達均顯著下調（P<0.05，P<0.01）。結論 青藤堿可通過下調TLR/MyD88通路中關鍵分子的表達抑制兔膝骨性關節炎軟骨免疫反應。

關鍵詞：青藤堿；骨關節炎；固有免疫；Toll樣受體；髓樣分化因子88；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）09-0049-03

Abstract： Objective To observe the effects of different doses of sinomenine on toll-like receptor （TLR）2， TLR4 and myeloid differentiation factor 88 （Myd88） in cartilage of rabbit knee osteoarthritis model； To discuss its mechanism of action. Methods Knee osteoarthritis model was established by Hulth method. Experimental rabbits were randomly divided into control group， model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups. Blank group received no processing. Model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups received intra-articular injection of normal saline and sinomenine 0.2 mL （5 mg）， 0.35 mL （8.75 mg） and 0.5 mL （12.5 mg） respectively， for 10 times. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in cartilage. Results mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in model group significantly increased compared with control group （P<0.01）； compared with model group， mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in sinomenine medium- and high-dose groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Sinomenine can inhibit the cartilage immune response of rabbit knee osteoarthritis by down-regulating expressions of key molecules in the TLR/MyD88 pathway.

Keywords： sinomenine； osteoarthritis； innate immune； toll-like receptor； myeloid differentiation factor 88； rabbits

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是由增齡及生物力學機制改變等因素引起的以關節軟骨損傷為中心，并累及病變關節周圍多種組織的退行性關節病。近年研究發現，包括炎性反應及固有免疫反應在內的生物學因素在OA發病中發揮了重要作用，OA滑膜炎性反應很可能是軟骨損傷激活機體固有免疫反應后出現的繼發過程，與OA的發生與進展緊密聯系在一起[1]。青藤堿是從防己科藤本植物青風藤中提取的生物堿單體，為青風藤的主要活性成分，具有鎮痛、消炎及免疫抑制等作用。課題組前期研究發現，青藤堿可抑制OA滑膜炎性反應，對關節軟骨具有保護作用[2]。本實驗以“固有免疫參與OA”為切入點，觀察不同劑量青藤堿對兔膝OA模型關節軟骨中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）2、4和髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）等TLR/MyD88通路中關鍵分子表達的影響，從免疫學角度探討青藤堿干預OA的相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物

新西蘭大白兔50只，雌雄各半，體質量2.0～2.4 kg，西安交大醫學院實驗動物中心，動物合格證號SCXK（陜）2014-003。標準飼料喂養，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～60%，正常光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

正清風痛寧注射液（主要成分為鹽酸青藤堿），湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1607405。β-actin、TLR-2、TLR-4和MyD88引物（南京金斯瑞生物科技有限公司），TLR2、TLR4和MyD88多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），RNA提取試劑盒及qPCR反應試劑盒（北京全式金公司）。AB7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司），濕式轉移電泳槽（美國BioRad公司），NanoDrop 2000C紫外分光光度計（美國Thermo公司），凝膠成像儀（美國BioRad公司）。

1.3 造模、分組及給藥

采用Hulth法[3]建立兔膝OA模型，術后6周隨機處死2只兔，行關節軟骨病理學檢查，結果顯示典型軟骨退變，表明造模成功。將50只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，青藤堿低、中、高劑量組膝關節腔分別注射正清風痛寧注射液0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg），模型組注射0.2 mL生理鹽水，以上4組每3 d干預1次，共干預10次，空白組不予處理。

1.4 標本采集

兔耳緣靜脈空氣栓塞法處死所有實驗動物，小刀仔細刮取右膝關節面軟骨，一部分保存于裝有RNA保存液的EP管，另一部分置于普通EP管，-80 ℃冰箱保存，分別留待qRT-PCR和Western blot實驗。

1.5 qRT-PCR檢測Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88 mRNA表達

用RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定純度和濃度，應用RNA反轉錄試劑盒反轉錄、合成第一鏈cDNA，最后于熒光定量PCR儀上進行擴增。操作方法均嚴格按照試劑盒說明進行。所有qRT-PCR設4個復孔，并設陰性對照，實驗重復3次，結果以2–ΔΔCt表示。引物序列見表1。

1.6 Western blot檢測Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88蛋白表達

將100 mg軟骨提取總蛋白后，以BCA法檢測定量，計算上樣量，SDA-PAGE凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，將一抗用封閉液稀釋并4 ℃過夜，TBST洗滌3次，于二抗工作液中室溫孵育1 h，TBST洗滌后加入ECL顯色液中，室溫振蕩，反應5 min，暗室中曝光、顯影、定影。使用Image J軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析，蛋白表達水平以目的條帶與內參β-actin條帶平均吸光度的比值表示。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，多組數據間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青藤堿對模型兔軟骨Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表2。

2.2 青藤堿對模型兔軟骨Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表3、圖1。

3 討論

固有免疫系統的激活主要依賴于對來自體內病原或損傷組織的保守序列的識別[4]。OA滑膜炎的發生機制與類風濕關節炎具有相似性，可能是軟骨損傷激活機體固有免疫反應后出現的繼發過程[1]。關節創傷、長期過度使用和增齡均可造成關節軟骨細胞及細胞外基質的破壞，并釋放能夠激活體內固有免疫系統的損傷相關性分子（damage-associated molecular patterns，DAMP）[5]。OA關節內的DAMP主要有蛋白及蛋白多糖的碎片、細胞崩解的殘留物[6]。固有免疫受體又被稱為模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR），PRR通過識別DAMP引發組織無菌性炎癥。TLR是PRR的一種，除廣泛存在于各類免疫細胞，TLR還可表達于OA病變軟骨和滑膜成纖維細胞[7]。OA患者軟骨損傷區域TLR2和TLR4的表達量顯著高于常人[8]。MyD88是TLR信號通路重要的下游分子，大多數TLR（TLR3除外）均通過MyD88途徑激活核因子-κB（NF-κB），引起組織中相應炎性介質的合成和釋放。青風藤來源于防己科植物青藤或毛青藤的干燥根莖，具有通絡、止痛、祛風濕的功效，主治風濕及類風濕關節炎、關節腫大、肢體疼痛、麻木等。現代藥理研究表明，青藤堿是青風藤中主要的活性生物堿，具有祛風鎮痛、消炎、免疫抑制、降壓及抗心律失常等作用[9]。文獻報道，青藤堿可抑制類風濕關節炎患者外周血樹突狀細胞TLR2/4的表達及NF-κB的活性，提示其對TLR/MyD88信號通路介導的固有免疫具有抑制作用[10-11]。

本實驗結果顯示，兔膝OA模型關節軟骨TLR2、TLR4和MyD88的表達顯著上調，中、高劑量青藤堿可顯著下調兔膝OA模型關節軟骨中TLR2、TLR4和MyD88的表達，低劑量青藤堿作用不明顯。這一結果表明，青藤堿有抑制OA固有免疫反應的作用，其機制與下調TLR/MyD88信號通路關鍵分子的表達相關。

參考文獻：

[1] SCANZELLO C， PLAAS A， CROW M. Innate immune system activation in osteoarthritis：is osteoarthritis a chronic wound[J]. Curr Opin Rheumatol，2008，20（5）：565-572.

[2] 鄭潔，王瑞輝，寇久社.青藤堿關節腔注射對膝骨關節炎兔軟骨和滑膜組織形態學及基質金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質蛋白的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2016，23（1）：74-77.

[3] HULTH J N， BARRACH H J， CHICHESTER C O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage，1999，7（6）：539-547.

[4] CHEN G Y， NU?EZ G. Sterile inflammation：sensing and reacting to damage[J]. Nat Rev Immunol，2010，10（12）：826-837.

[5] LIU-BRYAN R. Synovium and the innate inflammatory network in osteoarthritis progression[J]. Curr Rheumatol Rep，2013，15（5）：323.

[6] SOKOLOVE J， LEPUS C M. Role of inflammation in the pathogenesis of osteoarthritis：latest findings and interpretations[J]. Ther Adv Musculoskelet Dis，2013，5（2）：77-94.

[7] GOLDRING M B， OTERO M. Inflammation in osteoarthritis[J]. Curr Opin Rheumat，2011，23（5）：471-478.

[8] KIM H A， CHO ML， CHOI H Y， et al. The catabolic pathway mediated by Toll-like receptors in human osteoarthritic chondrocytes[J]. Arthritis Rheum，2006，54（7）：2152-2163.

[9] 曹吉慧，趙桂森，馮延江.青風藤的化學成分與藥理作用[J].國外醫藥：植物藥分冊，2008，23（2）：62-66.

[10] 余克強，羅仁.青藤堿對類風濕性關節炎患者外周血樹突狀細胞TLR2和TLR4表達的影響[J].中華中醫藥雜志，2009，24（3）：316-319.

[11] 趙毅，余克強，李娟.青藤堿對類風濕性關節炎樹突狀細胞核轉錄因子-κB活性的影響[J].廣東醫學，2006，27（1）：55-58.

（收稿日期：2018-03-21）

（修回日期：2018-04-23；編輯：華強）

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

內含全文PDF和增強文件