山西省奶牛副結核病的血清學調(diào)查

韓一超

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

副結核病（paratuberculosis）又稱副結核性腸炎，是由副結核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動物的一種慢性消化道傳染病，臨床診斷特征是慢性卡他性腸炎、頑固性腹瀉和逐漸消瘦，剖檢可見腸黏膜增厚形成皺襞[1]。病牛和隱性感染牛不僅糞便中可排出大量病菌，尿和奶中也能排菌。MUTHARIA等[2-3]研究表明，在被MAP感染動物的肝、脾、腎、肺、心臟或生殖器官中也檢測到了副結核分枝桿菌，其乳肉制品進入了人類的食物鏈，導致人類有感染副結核病的潛在風險。近幾十年國內(nèi)外大量研究表明，副結核分枝桿菌可引發(fā)人的克羅恩氏（Crohn's）病[4-5]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物傳染病。副結核病在1895年報道首例，我國在1975年由吉林農(nóng)業(yè)大學韓有庫等分離出此菌[6]。該病已在全世界分布廣泛，發(fā)病率呈上升趨勢，對養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，僅在美國造成的經(jīng)濟損失就高達200億美元[7-8]。

為了調(diào)查副結核病在山西地區(qū)奶牛群中的流行情況，本研究在山西地區(qū)開展了對不同規(guī)模奶牛養(yǎng)殖場副結核病的調(diào)查和抗體檢測，旨在為山西省控制該病提供科學依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

于2016年1—12月，在山西省規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場和個體養(yǎng)殖戶的奶牛群中，隨機抽取牛只，用一次性真空采血管在牛尾根靜脈無菌采血8～10 mL，斜面放置，析出血清后離心分離血清至1.5 mLEP管中，-20℃保存?zhèn)溆茫膊杉瘶悠?84份。

1.2 主要試劑

副結核分枝桿菌抗體檢測ELISA試劑盒，購自美國IDEXX公司。

1.3 方法

用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法進行檢測。本試驗所采用的副結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒是在微量反應板上包被了副結核分枝桿菌原液提取物，樣品先和草分枝桿菌提取物預孵育，可中和去除其他非特異性抗體。具體操作過程按照試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定

用酶標儀在450 nm波長下測定各孔的OD值。試驗結果成立的條件為：陽性對照OD450平均值≥0.350，且陽性對照OD450平均值與陰性對照OD450的比值≥3.00。

檢測樣品按照S/P的取值來判斷檢測結果。

S/P＝（樣品 OD450－陰性對照 OD450）/（陽性對照OD450平均值－陰性對照OD450）×100% （1）

其中，S表示樣品OD450平均值與陰性對照OD450之差，P表示陽性對照OD450平均值與陰性對照OD450之差。當樣品的S/P≥55%時，判定為陽性結果；當S/P≤45%時，判定為陰性結果；當45%＜S/P＜55%時，判定為可疑，應該進行重新檢測。

2 結果與分析

2.1 山西省奶牛副結核病血清學檢測結果

對山西省11個地區(qū)的規(guī)模化奶牛場和散養(yǎng)戶的784份血清進行ELISA檢測，結果顯示，陽性血清202份，陽性率為25.77%（表1）。說明在山西地區(qū)規(guī)模化奶牛場和散養(yǎng)戶的牛群中均存在奶牛副結核病，副結核病在山西地區(qū)奶牛群中流行比較嚴重，應引起飼養(yǎng)者和有關部門的重視。

表1 奶牛副結核抗體檢測結果

2.2 不同階段奶牛副結核病抗體檢測結果

由表1可知，犢牛、育成牛和成年牛的副結核病陽性率分別為10.34%，29.80%和36.94%。犢牛的副結核病陽性率低于育成牛和成年牛的副結核病陽性率。副結核病陽性率隨著奶牛年齡的增長而升高[9-10]，發(fā)生這種現(xiàn)象可能是由于病牛和隱性感染牛為傳染源，其從糞便、尿和奶中排菌，污染牛舍，犢牛通過吸食含副結核分枝桿菌的奶或接觸到環(huán)境中的病原菌而感染，導致整個牛群抗體陽性率處于較高的水平。另外，還可能是由于副結核分枝桿菌感染前期以細胞免疫為主，感染后體液免疫應答才增強，因此，隨著牛年齡的增長，血清學由陰性轉(zhuǎn)為陽性，導致副結核陽性率升高。成年牛的副結核病陽性率較高，是因為在采樣時主要采集有副結核臨床癥狀的牛。

2.3 不同規(guī)模奶牛場副結核病的檢測結果

表2 不同規(guī)模奶牛場副結核抗體檢測結果

從表2可以看出，在規(guī)模化奶牛場中，副結核抗體陽性率為16.67%～23.81%；散養(yǎng)戶副結核抗體陽性率為32.93%。散養(yǎng)戶奶牛的副結核陽性率比規(guī)模化奶牛場陽性率高9.12～16.26百分點。規(guī)模化奶牛場副結核抗體陽性率比散養(yǎng)戶陽性率低，可能是由于規(guī)模化奶牛場奶牛能分群飼養(yǎng)，隔斷了副結核分枝桿菌由糞便感染犢牛的途徑。

3 結論與討論

目前，奶牛副結核病廣泛流行于世界各國，尤其是奶牛養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達的一些國家，如英國、荷蘭、法國等，副結核病感染率在8%～33%[11-12]。林濤[12]對北京地區(qū)2個規(guī)模化牛場的326份血樣進行了副結核抗體檢測，結果顯示，陽性率分別為8.5%和32.4%。本研究調(diào)查結果顯示，山西地區(qū)奶牛副結核抗體陽性率為25.77%，與國內(nèi)外的調(diào)查基本相符，說明山西地區(qū)奶牛群中副結核流行嚴重，應引起飼養(yǎng)者和有關部門的重視。

對于牛副結核病，目前尚無有效的治療方法，檢出、隔離或淘汰感染動物是根除該病的唯一辦法。副結核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，奶牛在幼年期感染后會有一個較長的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出臨床癥狀，感染前期以細胞免疫為主并伴隨著間歇排菌，經(jīng)過2～5 a的亞臨床期后體液免疫應答增強，同時排菌量明顯增加[13]。對副結核病的檢測，應針對不同的感染階段，采用不同檢測原理的檢測方法才有可能提高檢出率。由于ELISA方便、成本低，是目前應用最廣泛的檢測方法。在用ELISA篩選出血清陽性牛之后，只有通過糞便抗酸染色，檢測出其中的排菌牛并將其隔離，以阻斷糞口傳播，使犢牛盡可能減少接觸該細菌，才能在牛群中成功地防治該病。