河南省豬腸外致病性大腸桿菌毒力因子的檢測及分布

徐引弟 ，張青嫻 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文強 ，李海利 ，郎利敏 ，王克領

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南鄭州450002）

腸外致病性大腸桿菌（（Extraintestinalpathogenic Escherichia coli，ExPEC）是引起世界性疾病的主要病原，可引起各種腸道外疾病，包括新生兒腦膜炎、膿毒癥以及泌尿道疾病，已經報道它在歐洲和北美引起動物和人的死亡，ExPEC由于分離部位和遺傳模式而區分于腸內致病性大腸桿菌和共生型大腸桿菌[1-4]。

ExPEC是養豬業的一個主要病原，引起嚴重的經濟損失，隨著我國養豬業工業化的快速發展，豬ExPEC的暴發呈上升的趨勢，成了迫切需要解決的問題。而且，人和動物分離的ExPEC分離菌之間的相似性表明，ExPEC存在不同的宿主之間交叉感染的可能性，包括人、伴侶動物、豬和禽類[5-8]。近年來，豬大腸桿菌病的報道日益增多，特別是高致病力ExPEC的報道逐年增多，已經給我國的養豬業造成重大的損失[9-18]。

本試驗對2017年分離自河南省豬場豬ExPEC進行了毒力試驗和毒力因子的鑒定，并對河南省ExPEC在豬群中的流行現狀、毒力特性等進行研究，旨在為預防和控制該病的流行提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料及菌株 來自于2017年1—12月河南省養豬場發生呼吸困難、敗血癥、關節炎及神經癥狀的發病及死亡豬的腦、肺、氣管、心血、關節液等病料共148份，質控菌ATCC25922購自中國獸藥監察所。

1.1.2 培養基及試劑 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）和胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy broth，TSB）購自Difco公司。麥康凱瓊脂（Maconkey Agar，MC）購自北京奧博星生物技術公司。Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、50×TAE濃縮液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq Mix，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制

1.2.1.1 TSA固體培養基 4 g TSA瓊脂粉，溶于100 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加胎牛血清5 mL，傾倒平皿。于4℃保存備用。

1.2.1.2 TSB液體培養基 含TSB肉湯粉3 g，溶于100 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加胎牛血清5 mL。于4℃保存備用。

1.2.1.3 TSA血平皿 TSA固體培養基滅菌后冷卻至45℃，加脫纖綿羊血5 mL，傾倒平皿。于4℃保存備用。

1.2.1.4 MC瓊脂平皿 5 g MC瓊脂溶于100 mL超純水中，121℃滅菌15 min，冷卻至45℃，傾倒平皿。于4℃保存備用。

1.2.2 引物設計 參考文獻[9-10，12-13]，根據大腸桿菌uid A基因序列設計引物，用于大腸桿菌的擴增，設計15個毒力因子包括kpsMTⅡ，kpsMTⅢ，iroN，fyuA，ireA，iutA，papC，papA，fimH，afa，vat，ompA，traT，usp和 ibeA基因的引物，分別用于ExPEC的15個毒力因子的擴增，引物序列如表1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR鑒定所用靶基因及引物

1.2.3 ExPEC的分離鑒定 其參考文獻 [9-10]進行。取病死豬肝臟、肺臟、氣管、心血、關節、腦組織等，在無菌條件下，涂布于TSA平板上，置于37℃5%的二氧化碳培養箱中過夜。在TSA平皿上，挑取疑似菌落于麥康凱平板上，培養12～24 h后，挑取紅色菌落革蘭氏染色。將純化后的疑似菌挑取少量單菌落溶解于30 μL無菌水中，按照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒操作提取DNA，擴增uid A基因。

1.2.4 致病性試驗 將分離鑒定好的ExPEC接種于不含血清的TSB培養基，37℃250 r/min振搖培養24 h。用生理鹽水稀釋菌數約為109cfu/mL，腹腔注射小白鼠0.2 mL；同時設生理鹽水為陰性對照。接種后觀察發病及死亡情況，剖檢小白鼠，無菌取其心血分離細菌并鑒定。

1.2.5 毒力因子鑒定方法的建立 DNA的提?。喝〖兓蟮木溥m量于50 μL純水的EP管中，按照DNA提取試劑盒說明操作，用表1中15對毒力因子的引物進行擴增。

反應體系為 25 μL，其中，2×Taq Mix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。反應條件為95℃預變性5 min；95℃1 min，57℃1 min72℃ 30 s，共 35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物4℃保存。取10 μL擴增產物電泳，紫外光下觀察結果，陽性產物測序。1.2.6 毒力因子的分布 對2017年1—12月分離鑒定的ExPEC進行15個毒力因子的檢測，陽性測序比對，統計毒力因子的分布情況。

2 結果與分析

2.1 ExPEC的分離鑒定結果

在TSA平皿上可見到凸起、圓形、光滑、濕潤、不透明、邊緣整齊、直徑2～3 mm的黃色菌落（圖1），在麥康凱平皿上長出玫紅色、光滑的圓形菌落（圖2）。革蘭氏染色為革蘭氏陰性粗桿菌（圖3）。PCR鑒定結果如圖4所示，在264 bp處有目的條帶，與預期相符。

2017年1—12月，從河南省35家豬場送檢的病死豬組織148份樣品，一共分離到腸外致病性大腸桿菌52株。

2.2 ExPEC的致病性分析

所有分離鑒定的ExPEC接種小鼠24 h內死亡，取死亡鼠心血接種TSA平皿。結果分離出純的經鑒定與ExPEC一致的細菌，證明為ExPEC，其對小鼠有毒力。

2.3 毒力因子PCR鑒定結果

用ExPEC的15對毒力因子的引物擴增，結果分別擴增出與預期大小相符的片段（圖5），測序與GenBank中所有ExPEC毒株的序列同源性均在98%～100%。

2.4 毒力因子的分布

將鑒定好的52株ExPEC進行15個毒力因子的擴增，結果統計列于表1。毒力基因的流行程度是不同的，其中，ompA，traT基因在所有分離株中都含有，其次為fimH，iutA，vat，iroN，其含量分別為86.5%，67.3%，63.5%，61.5%，最少的是 usp，kpsMTⅢ基因，只有1株。分離體含有的毒力基因最多的有10個（9，40，46號菌），其次含有9個毒力基因（1，18，30，39，51，52 號菌），最少的僅含有 ompA，traT基因（2，3號菌）（表 2，表 3）。陽性結果測序，同源性均在98%以上。

表2 15個毒力基因在52株ExPEC中的分布

表3 15個毒力基因分布統計

3 結論與討論

2006年以來，河南省農科院畜牧獸醫研究所傳染病研究室從河南省發病豬場的豬腸外組織分離出300多株ExPEC，大部分豬場能分離到ExPEC?？梢?，豬ExPEC流行廣，病原復雜。豬源ExPEC已成為威脅我國養豬業的主要細菌性疾病之一，2017年分離52株，在豬群的分離率為30%以上[12-13]。

人們已經認識到ExPEC的重要性，北美和歐洲報告了許多在牛、人和食物與ExPEC有關的疾病，可致使不同宿主發生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染。在我國養豬業中，ExPEC已成為一種常見的致病菌。然而，對ExPEC發病機制和流行病學的認識還很有限。JOHNSON等[6-7]提出了一種分子方法，ExPEC中5個毒力標記（PapA/Papc，sfa/foc，afa/dra，iutA 和 kpsMTⅡ）中至少有 2個標記定義為ExPEC。根據該標準，在本研究的52株菌株中，有22株被鑒定為ExPEC。表明JOHNSON等的標準更嚴格、更有選擇性，且能識別出具有較高致病潛力的菌株。單一的毒力因子并不能決定細菌的致病性[18-23]。因此，本研究篩選出15個主要的毒力相關基因進行分析，旨在揭示與毒力相關的基因型性狀。TAN等[10]研究表明，fimH（85.4%），traT（76.8%），iroN（70.2%），iutA（66.7%），fyuA（56.8%）和 kpsMTⅡ（56.8%）在豬ExPEC分離物中非常普遍，所占比例均在50%以上。這與本研究結果基本一致，而kpsMTⅡ，ibeA，papA，papC 差異較大。ZHU等[9]的研究中，iutA，vat，fimH，traT 和 ompA 比例均在 60%以上，而且ompA在每株菌里均能檢測到，cnf1，focG，ibeA，kpsMTⅢ，afa，hlyD，sfaS，papA 低于 10%，focG未檢測到。這與本研究類似，但本研究中，traA，iroN，papA，afa，fyuA比例比ZHU等的研究結果高。因此，毒力基因的檢測在不同的研究中比例會有所差異，這可能與分離菌的來源、毒力、地域差異等有關。由于本研究只進行了小鼠的致死試驗，而沒有測定每一株菌的半數致死量，因此，每株菌的毒力差異及與毒力基因的分布關系無法確定，還需進一步研究或收集更多的ExPEC分離物得到驗證。

豬ExPEC病的發生不同地域間無明顯差異，與季節關系較大，冬春季發病率相對較高，而夏秋季較少，這與氣溫、通風等條件有較大關系。通過對豬ExPEC的毒力及毒力基因進行研究，為河南省豬ExPEC病的基礎研究、診斷、預防與控制提供了一定的理論依據。