糖尿病腎病大鼠血清miR-146a表達及其與炎癥指標和氧化應激指標的相關性

高艷飛

(遼河油田總醫院檢驗科，遼寧盤錦 124010)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病患者常見并發癥之一。我國DKD的發病率呈不斷上升之勢，研究顯示20%～45%的糖尿病患者存在不同程度的腎臟損傷，如不及早干預將進展為終末期腎病[1-2]。有關DKD具體發病機制和病理基礎尚未完全闡明，越來越多的證據表明炎性反應和腎臟氧化應激損傷是引起DKD發病的重要環節[3-4]。有關miRNA在DKD發病過程中發揮的作用逐漸引起眾多學者的重視。近年來研究發現miR-146a的表達在合并周圍神經病變、糖尿視網膜病變等并發癥的糖尿病患者中發生改變[5-6]。本研究主要分析DKD模型大鼠血清miR-146a的表達，及其與大鼠炎性反應和氧化應激指標的相關性。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雌雄大鼠100只，體質量203～215 g，購自中國科學院斯萊克實驗動物中心(SCXK京2011-0012)，購回后適應性飼養2周后再用于實驗。按照隨機數字表法分為對照組(n=50)和模型組(n=50)。

1.2儀器與試劑 鏈脲佐菌素(Sigma公司，美國)；TRIzol總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)；反轉錄試劑盒(ABI Applied Biosystems，美國)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；核轉錄因子-κB (NF-κB)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β和高級氧化蛋白產物(AOPPs)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(美國R&D Systems公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑(上海銘博生物科技有限公司)；TBA-40FR全自動生化分析儀(日本東芝公司)；尿清蛋白放射免疫測定試劑盒(中國原子能科學院同位素研究所)。

1.3DKD大鼠模型構建 對照組和模型組分別給予基礎飼料和高糖高脂飼料(基礎飼料64%、豬油8%、蛋黃粉9%、蔗糖18%、膽酸鈉1%)喂養。8周后，模型組大鼠采用無菌枸櫞酸鈉緩沖液配制的鏈脲佐菌素(40 mg/kg)行腹腔注射，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，分別予以之前的飼料繼續喂養4周。4周后，采集大鼠尾靜脈血，TBA-40FR全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)；代謝籠留取24 h尿液，采用放射免疫法測定尿清蛋白水平(μg/mL)，計算24 h尿蛋白排泄率(UAER，μg/min)=尿清蛋白水平×24 h尿液總量(mL)/60 min×24 h。若空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，UAER>30 mg/24 h，則視為造模成功。

1.4RT-PCR檢測血清miR-146a表達 采集2組大鼠尾靜脈血，TRIzol法提取血清總RNA，按反轉錄試劑盒操作說明反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，引物miR-146a上游：5′-GGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3′，下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。U6上游：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。擴增條件：95 ℃,10 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s；72 ℃,15 s；55 ℃,15 s；共計40個循環。采用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.5炎性反應和氧化應激指標檢測 采集2組大鼠尾靜脈血，采用ELISA法測定NF-κB、TNF-α、IL-1β、AOPPs水平。采用硫代巴比妥酸法和化學比色法測定MDA和SOD水平。

2 結 果

2.1血清miR-146a表達比較 對照組和模型組大鼠血清miR-146a表達量分別為23.14±5.81、14.67±4.59，模型組大鼠血清miR-146a表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(t=5.720，P<0.05)。

2.22組血清NF-κB、TNF-α和IL-1β水平比較 模型組大鼠血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.32組血清SOD、MDA和AOPPs水平比較 模型組大鼠血清MDA和AOPPs水平明顯高于對照組，SOD水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平比較

表2 2組血清SOD、MDA和AOPPs水平比較

2.4miR-146a與各指標的相關分析 模型組大鼠血清miR-146a與NF-κB、TNF-α、IL-1β、MDA和AOPPs呈顯著負相關(P<0.05)，與SOD呈顯著正相關(P<0.05)。見表3。

表3 miR-146a表達與各指標的相關分析

3 討 論

miR-146a定位于人類基因染色體的5q34位點上，是一個典型的多靶基因調節器。已有研究顯示miR-146a在糖尿病周圍神經病變和糖尿視網膜病變等糖尿病并發癥患者中的表達下降[5-6]。那么miR-146a在DKD發生、發展中扮演何種角色？miR-146a與慢性炎性反應和腎臟氧化應激損傷之間又存在何種聯系？目前仍鮮有文獻報道。本研究結果顯示，模型組大鼠血清miR-146a表達明顯低于對照組，這說明miR-146a可能在DKD的發生、發展中起重要作用。

NF-κB信號通路是重要的炎性反應通路，在免疫應答、炎性反應、細胞增殖和凋亡等多種過程中發揮調控作用。TAGANOV等[7]學者研究發現，在TNF-α 和IL- 1β等刺激下，通過NF-κB 通路上調miR-146a表達；而miR-146a反過來通過TNF受體相關因子6(TRAF6)和IL-1受體相關激酶1(IRAK1)，減少下游IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的表達，從而形成一個負反饋調控過程。此外，HE等[8]學者證實，miR-146a是Notch的直接靶基因，可通過Notch信號通路途徑調控其下游各種炎癥因子的表達。本研究結果發現，模型組大鼠血清NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平均明顯高于對照組，相關性分析顯示模型組大鼠血清miR-146a表達與NF-κB和TNF-α呈負相關。這也進一步證實了miR-146a可通過調節NF-κB及其下游炎癥因子的表達參與DKD的發生、發展。

氧化應激損傷在DKD的發生、發展中起關鍵作用。高糖誘導細胞內活性氧(ROS)產生增加，導致ROS生成和清除失衡[9-10]。一方面，ROS增加會導致腎小球濾過膜上的負電荷丟失，破壞腎小球濾過屏障，帶負電荷的清蛋白易于從腎小球濾過膜溢出。長期蛋白尿會導致腎小球和腎小管損傷。另一方面，ROS引起的氧化應激反應，致使脂質過氧化產物蓄積，引起腎臟損傷。SOD、MDA和AOPPs是評價機體氧化應激狀態的常用指標，其水平反映了機體氧化應激損傷的嚴重程度。血清miR-146a表達變化與機體氧化應激損傷之間存在何種聯系？尹斌等[11]學者研究顯示，miR-146a可減輕過氧化氫所致人胃腺癌細胞株的氧化應激損傷，過表達miR-146a可明顯增加細胞SOD活力，減少MDA水平。本研究結果顯示，模型組大鼠血清MDA和AOPPs水平明顯高于對照組，SOD水平明顯低于對照組，說明模型組大鼠存在明顯的氧化應激反應，腎臟氧化應激損傷可能是導致DKD發生、發展的重要原因。

綜上所述，DKD大鼠血清miR-146a表達降低，可能參與了炎性反應和腎臟氧化應激損傷，從而參與DKD的發生、發展。miR-146a有望成為DKD的潛在分子標志物之一，從而指導疾病的診斷和治療。