遵義地區(qū)4 055例珠蛋白生成障礙性貧血基因分型結果分析

李 彥，陳秋月，晏亞萍，肖代敏

(遵義醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，貴州遵義 563003)

珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)是一種由遺傳性珠蛋白基因缺陷(缺失或突變等)導致的慢性溶血性貧血。根據(jù)珠蛋白4種肽鏈合成障礙的不同，可將地貧分為α、β、γ和δ 4種類型，其中以α-地貧和β-地貧最為常見[1]。該病廣泛分布于世界各地，主要集中在地中海沿岸地區(qū)及東南亞地區(qū)，在我國以廣東、廣西、海南、貴州、四川發(fā)病率高。迄今為止，臨床對地貧患者的治療主要是以對癥治療為主，對地貧的根治仍缺乏切實有效的方法。因此，把好三關(婚檢、孕檢和產檢)對預防地貧患兒的出生是最為重要的手段和方法。遵義地處于重慶與貴陽之間，常住人口近1 000萬，目前較少見本地區(qū)人群地貧基因缺陷的有關文獻報道。因此，本研究采用熒光聚合酶鏈式反應(PCR)溶解曲線法對本地區(qū)人群，尤其是孕期女性及疑似地貧患者進行地貧基因檢測，旨在探討遵義地區(qū)地貧的發(fā)生率及基因型分布情況，為遺傳篩查和產前診斷提供科學依據(jù)，以期達到預防和控制地貧患兒出生和實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育的目的。

1 資料與方法

1.1一般資料 2016年6月至2018年3月在遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院進行地貧基因檢測的遵義地區(qū)常住人員共計4 055例，其中孕檢及體檢篩查人員3 391例，血液內科疑似地貧患者[平均紅細胞體積(MCV)<80 fL和 (或)平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)<26 pg]664例，男女不限，年齡0～60歲。

1.2儀器與試劑 Lab-aid824全自動核酸提取儀及配套的磁珠法核酸提取試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)， SLAN-96P Real-Time PCR-儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)，缺失型α-地貧、非缺失型α-地貧和β-地貧基因檢測試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)，XE-5000的全自動五分類血細胞分析儀及配套試劑(日本Sysmex有限公司)。

1.3方法

1.3.1血常規(guī)篩查 采集靜脈血3 mL，用全自動五分類血細胞分析儀檢測MCV和MCH，以MCV<80 fL和(或)MCH<26 pg為標準判為疑似患者。

1.3.2DNA提取 抽取檢測者外周血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，嚴格按操作說明書，通過磁珠法應用全自動核酸提取儀提取人類基因組DNA，備用。

1.3.3地貧基因檢測 采用熒光PCR溶解曲線法，通過熒光探針與PCR產物雜交后熔點的變化檢測基因是否突變或缺失。根據(jù)試劑盒說明書，分別配制β、缺失型α、非缺失型α的反應液于PCR薄壁反應管中，并按順序加入5 μL提取的DNA樣品、陰性及野生型對照，短暫離心后，放置于SLAN-96P 實時熒光PCR儀，進行PCR擴增及溶解曲線分析。擴增條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s、76 ℃ 45 s，10個循環(huán)；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、76 ℃ 45 s，50個循環(huán)；溶解曲線分析程序：95 ℃ 1 min；35 ℃ 3 min；40～85 ℃，設置在此階段每0.4 ℃采集FAM、HEX、ROX和Cy5通道熒光信號。

1.4結果判斷 比較待測標本在4個不同檢測通道與野生型對照之間熔解峰(Tm值)的差異來綜合判斷標本的基因型，具體檢測結果參照說明書和通過儀器自動判讀進行分析。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1不同就診對象地貧基因陽性檢出率 4 055例受檢者中，3 391例為孕檢、體檢篩查者，664例為血液內科送檢疑似患者，孕檢、體檢篩查者中檢測出地貧基因陽性399例，陽性率為11.77%，其中雙重復合為19例；疑似患者中檢測出地貧基因陽性388例，陽性率為58.43%，其中雙重復合為26例。疑似患者地貧基因陽性率明顯高于孕檢、體檢篩查者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2地貧基因缺陷類型分布 4 055例受檢者中，檢測出α-地貧408例，占49.04%，β-地貧424例，占50.96%，共包含17種基因型，其中α-地貧以α缺失型αα/-α3.7最多，含雙重復合型雜合子在內共184次，占22.12%，其次是α缺失型--SEA/αα，含雙重復合在內共166次，占19.96%；β-地貧以CD17最多，含雙重復合在內共178次，占21.40%，其次是CD41-42，含雙重復合在內共107次，占12.86%；在試劑盒范圍內未檢測出的基因型別有CD14-15、CD15-16、-30、-31、-32、CD31、IVS-Ⅰ-1、CD30、IVS-Ⅱ-5、-73、-90。見表1。

表1 地貧基因型別構成比

2.3地貧基因雙重復合型分布 4 055例受檢者中共檢測出雙重復合45例，檢出率為1.11%，其中以α-地貧復合α-地貧為主，共33例，占73.34%，主要以--SEA/-α3.7為主，共21例，占46.67%；α-地貧復合β-地貧共12例，占26.66%；未檢測出β-地貧復合β-地貧。

表2 地貧基因復合型別構成比

3 討 論

地貧是我國南方常見的單基因遺傳疾病，嚴重危害著人類健康，雙方為地貧基因攜帶者的夫妻下一代有四分之一的概率患重型地貧[2]，且目前對重型地貧尚無有效的治療方法，僅通過長期輸血維持生命，而長期反復輸血會導致患兒體內鐵負荷過重，最終導致心、肝等重要器官損傷、衰竭。因此，對育齡夫婦進行地貧基因篩查，對地貧基因攜帶夫婦妊娠后進行產前地貧基因診斷，是降低重型地貧患兒出生率的唯一有效途徑[3]，也是國際上公認的地貧預防對策[4]。

地貧發(fā)病具有地域性，不同地區(qū)發(fā)病率不同。我國長江以南發(fā)病率較高。主要以海南、廣西、廣東、貴州、重慶等地區(qū)攜帶率較高，調查顯示，海南地區(qū)地貧攜帶率高達50%[5]，廣西地區(qū)達到20%[6]，廣東、貴州、重慶等地區(qū)也有10%左右的攜帶率[7-10]。本研究結果顯示3 391例孕檢、體檢篩查者地貧基因檢測陽性率為11.77%，略高于貴州地區(qū)地貧基因攜帶率，說明遵義屬于貴州地區(qū)地貧高發(fā)地區(qū)，因此更應重視婚前及孕前的地貧基因篩查及產前診斷工作。而664例疑似患者的地貧基因檢測陽性率為58.43%，明顯高于孕檢、體檢篩查者的陽性率，與何麗等[11]報道的重慶地區(qū)MCV、MCH低于健康者人群地貧基因檢測陽性率較高結果類似，說明MCV、MCH的檢測在地貧初篩中有重大的臨床意義。

本研究中4 055例受檢者共檢測出α-地貧408例，占49.04%，β-地貧424例，占50.96%，α-地貧和β-地貧的發(fā)生率均衡，沒有偏向性。相關調查報道顯示貴州、重慶地區(qū)以β-地貧為主，廣東、廣西、海南等地區(qū)以α-地貧為主[5-10]，本研究結果與之均不相符。說明遵義地區(qū)地貧基因型有其自身獨有的特點，在篩查中應對α-地貧和β-地貧同時進行檢測，以免發(fā)生漏診。此次研究共檢測出17種基因型，其中α-地貧以α缺失型αα/-α3.7最多，占22.12%，其次是α缺失型--SEA/αα，占19.96%，與莫亞虹等[12]報道的海南地區(qū)最常見的α-地貧基因型是αα/-α3.7一致，但與其他地區(qū)報道α-地貧以α缺失型--SEA/αα為主不同[5-10]；β-地貧以CD17為最多，占21.40%，其次是CD41-42和IVS-Ⅱ-654，分別占12.86%和10.46%，與貴陽、重慶β-地貧基因型別發(fā)生率排序相同[13],但與國內廣東、廣西、海南地區(qū)所報道的β-地貧基因型別以CD41-42為主，其次是IVS-Ⅱ-654和CD17的排序不一致[14-15]。說明不同區(qū)域，地貧基因型別也不同，但也許相鄰地區(qū)型別分布較為類似。

綜上所述，遵義是地貧高發(fā)地區(qū)，必須加強地貧知識的宣傳、普及，從預防、治療和信息管理等方面入手，控制地貧基因的蔓延，做好地貧基因篩查工作，對血常規(guī)異常者應進一步檢測地貧基因，降低地貧漏診率，通過產前篩查，降低地貧患兒出生率，提高人口素質，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。