可視化檢測技術測定前列腺特異抗體的應用*

李 敏,韓笑杰

(浙江工業大學藥學院,杭州 310014)

前列腺特異抗體(PSA)是一種hKLK3基因編碼，由前列腺上皮細胞分泌的單鏈糖蛋白，主要被分泌到前列腺液中，水解精液凝固蛋白，使精液液化。PSA在前列腺中水平較高，在血清中水平則較低。前列腺癌患者的血清中可檢測到較正常值略高的PSA。PSA作為前列腺癌的腫瘤標志物，對于前列腺癌的預防、治療和預后有重要作用。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法檢測技術，目前從男性血清中可檢測到0～4 ng/mL的PSA，當PSA水平更低時，由于ELISA信號檢測靈敏度較低，就無法檢測。本研究改良ELISA最后一步的信號放大系統，使信號發生與過氧化氫減少導致的納米膠體金顏色的變化聯系在一起，實現用肉眼來觀測檢測結果。由于應用了納米技術，使檢測信號更加靈敏。

1 材料與方法

1.1材料 實驗使用的生化試劑三水合氯金酸、30%H2O2、蔗糖、BSA均購于生工生物工程(上海)有限公司。ELISA緩沖液購于生工生物工程(上海)有限公司。PSA標準品購于Sigma-Aldrich公司。ELISA使用的鼠抗PSA單克隆抗體、兔抗PSA、生物素修飾羊抗兔IgG和鏈霉親和素-HRP均購于生工生物工程(上海)有限公司。實驗使用的SC-T45分光光度計購自光量國際貿易有限公司。

1.2方法

1.2.1納米金膠體顏色變化的H2O2臨界值研究 H2O2是一種既具有氧化性，又具有還原性的物質。H2O2具有強氧化性，充足的 H2O2可以將氯金酸中的金離子還原為納米金顆粒，納米金粒徑較小，分布均勻，反應液呈紅色。H2O2制備納米金的反應是可逆的。當反應液中的H2O2水平降低時，已經形成的納米金膠體會發生聚集，形成較大顆粒，其折射光線的能力瞬間發生改變，溶液就會從紅色轉變為藍色。由于納米金顏色的轉變取決于納米金顆粒的大小，極微弱的H2O2水平改變就會導致納米金顆粒大小的變化，從而導致顏色的變化。測定導致顏色發生瞬變的H2O2臨界值水平，是實現可視化檢測的關鍵步驟。

實驗全過程都需要添加膠體金顆粒的保護劑，以維持膠體金的穩定。實驗選取蔗糖作為保護劑，研究H2O2產生納米金顏色變化的臨界值。具體方法：將三水合氯金酸溶解在蔗糖(0.2 mmol/L,pH6.5)中，制備0.1 mmol·Lol-1·L-1的氯金酸溶液。酶標板用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，然后用去離子水洗2次，在酶標板中加入不同水平的H2O2，使終水平為0、20、40、60、80、100、120 μmol/L，每個相鄰孔的差值在20 μmol/L。然后在酶標板每個孔中加入0.1 mmol/L的氯金酸溶液。該方法研究H2O2導致變色的臨界水平和差值，評價檢測系統的可行性和靈敏度。孔中的樣品顯色后，用光度計測定每個孔中液體的最大吸收波長。納米金膠體在穩定的狀態下，最大吸收波長在550 nm，呈現紅色。當納米金發生聚集，顆粒變大時，最大吸收波長會發生紅移，波長將大于550 nm。臨界值認定為H2O2的終水平(加入等體積氯金酸后稀釋1倍)，而不是加入量。

1.2.2前列腺癌標志物PSA的可視化檢測 H2O2水平的改變可以引起納米金顏色的改變，獲得H2O2臨界值核心數據后，即可設計PSA的可視化檢測方法。前面的步驟與ELISA雙抗體夾心方法一致。在最后的信號放大時，當測試樣品有PSA時，處于臨界值的H2O2會被鏈霉親和素-HRP消耗，與H2O2水平密切相關的納米金粒徑發生改變，顏色就會從紅色變為藍色，實現PSA的可視化檢測。操作方法：96孔酶標板加入鼠抗PSA的單克隆抗體100 μL，用PBS 按照1∶1 000稀釋，4 ℃包埋過夜。洗滌液洗板3次后，用封閉液[標準蛋白質溶液(BSA)溶解于PBS]，室溫封閉1 h。洗滌液洗板3次，加入用BSA稀釋的不同水平PSA標準品100 μL，室溫反應2 h。洗滌液洗板3次，加入兔抗PSA，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應2 h。洗滌液洗板3次，加入生物素修飾羊抗兔IgG 100 μL，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應1 h。洗滌液洗板3次，加入鏈霉親和素-HRP結合物100 μL，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應30 min。洗滌液洗3次，PBS洗2次，去離子水洗2次，加入200 μmol·Lol-1·L-1H2O2100 μL，室溫反應30 min后，加入新鮮配制的0.1 mmol·Lol-1·L-1氯金酸溶液100 μL。30 min后，觀察酶標板孔中的顏色變化。PSA標準品的稀釋水平為10-8、10-9、10-10、10-11、10-12g/mL。實驗對照品為BSA，操作步驟與PSA的一致。

2 結 果

2.1H2O2臨界值的測定 當H2O2水平高于100 μmol/L時，孔中溶液呈現紅色，其最大吸收波長經測定在550 nm左右，見圖1。當H2O2水平小于100 μmol/L時，肉眼可以清晰辨認為藍色，其最大吸收波長發生紅移，經測定在580 nm左右，見表1。

注：①～⑤實際為紅色；⑥～⑦實際為藍色

圖1不同H2O2水平反應的膠體金顏色轉變

表1 不同H2O2水平反應的膠體金的光學性質研究

2.2前列腺癌標志物PSA的測定 通過檢測不同的PSA水平，發現當PSA水平為10-8、10-9、10-10g/mL時，都顯示出藍色，當水平為10-11、10-12g/mL時，顯示紅色，見圖2。以BSA作為對照，所有水平結果均顯示為紅色。

注：①～③實際為紅色；④～⑩實際為藍色

圖2 PSA可視化檢測結果

3 討 論

本實驗結果表明，當H2O2水平高于100 μmol/L時，加樣孔中的氯金酸在H2O2的還原作用下，全部都轉變為穩定的膠體金顆粒，呈現紅色，其最大吸收波長經測定在550 nm左右。當H2O2水平小于100 μmol/L時，肉眼可以清晰辨認為藍色，其最大吸收波長發生紅移，經測定在580 nm左右。因此確定發生顏色變化的H2O2臨界值為100 μmol/L，實現顏色轉變的差值為20 μmol/L，差值的水平區間很小，提示新型檢測方法的靈敏度較高。H2O2臨界值的測定為設計可視化檢測方法，提供了重要的數據支持。使用雙抗體夾心法對PSA進行檢測，前期步驟與常規ELISA相同，在最后一步的顯色反應中，用辣根過氧化物酶去作用處于顯色臨界值的H2O2。這樣，如果檢測體系中存在PSA，檢測系統就會存在消耗H2O2，微量H2O2水平的改變就會引起顏色變化。表明該種檢測方法的PSA最低檢測限為10-10g/mL，比目前臨床上使用的PSA ELISA試劑盒靈敏度要高。由于檢測系統應用了雙抗體夾心法，包埋抗體為抗PSA的單克隆抗體，檢測的準確率也較高。可視化檢測技術的最大優點是無需使用酶標儀，直接用肉眼就可以對結果進行觀察，適用于普通實驗室。

腫瘤的早期檢測是治愈腫瘤的最佳手段[1-2]。在臨床上，腫瘤標志物PSA的檢測對前列腺癌的早期診斷、治療和預后具有重要的意義[3-6]。目前使用的ELISA試劑盒檢測血清PSA水平靈敏度較低，有假陽性、倒鉤現象，這些缺陷都是使用酶標儀引起的[7-8]。HAESE等[9]在臨床上檢測PSA，應用普通ELISA技術，可以檢測的PSA水平為4 ng/mL。KOBORI等[10]在臨床上檢測PSA，應用普通ELISA技術，可以檢測的PSA水平為2 ng/mL。本文所構建的可視化檢測系統可以作為檢測PSA的有效檢測方法，其檢測靈敏度達到0.1 ng/mL，要比HAESE等[9]和KOBORI等[10]的檢測結果靈敏20～40倍。可視化檢測技術無需使用酶標儀，因此克服了由酶標儀引起的ELISA倒鉤、假陽性等檢測缺陷。可視化檢測技術由于不需使用昂貴的檢測儀器，通過肉眼觀察顏色改變判定檢測結果，具有操作簡單，靈敏度高，檢測費用低等優點。改變的顏色色系為從紅色變為藍色。未超標樣品的檢測結果為紅色，如果樣品中的腫瘤標志物超標，則呈現藍色。紅色轉變為藍色肉眼極易察覺。因此，這是一種設定了某個標準值后，界定是否超標的檢測技術。當需要調整標準值時，只需對樣品的稀釋度進行調整就可以。當然，該方法也具有一定的局限性，該方法只能針對最低檢測限度做出定性的檢測，而不能對單一樣品的水平進行精確的測定。

腫瘤標志物可視化檢測技術只需肉眼觀察就可判斷結果，無需使用儀器，檢測成本低，可以應用于貧困地區及條件差的實驗室。該項技術應用納米材料的顏色變化來設計信號傳遞方式。這種基于納米反應的生物信號傳遞方式較ELISA發光機制能使生物信號最大限度地放大。因此，腫瘤標志物可視化檢測技術靈敏度極高，某些由于水平低而無法檢測的腫瘤標志物可以被測定，為檢測多種腫瘤的腫瘤標志物復合物篩查創造條件。已能檢測的腫瘤標志物當提高檢測靈敏度后，腫瘤標志物檢測水平可以進一步降低，使已經發生腫瘤但由于腫瘤標志物水平低而檢測為假陰性的患者，能夠在腫瘤早期做出診斷，減少假陰性的發生率。

綜上所述，腫瘤標志物可視化檢測技術操作簡單，費用低，可廣泛應用于貧困地區居民和普通人群的腫瘤篩查，從而大幅度提高我國腫瘤早期診斷率，使大量腫瘤患者能在早期得到有效治療，延長生存時間，為真正征服惡性腫瘤帶來希望。該項技術既能提高公民的健康水平和生活質量，又能節約國家醫療資源和投入，具有較好的社會效益。