中華大蟾蜍EDF-1重組蛋白的原核表達、純化及抗血清的制備

劉怡君 賈宇坤 王玲芳 劉虹杏 楊仙玉

（浙江農林大學動物科技學院，臨安 311300）

內皮分化相關因子-1（Endothelial differentiation related factor-1，EDF-1）最早是在HIV-1-Tat處理的人類內皮細胞中分離的，具有抑制血管內皮細胞分化的作用［1-2］，而腫瘤的生長和演進需要形成新血管來提供營養物質，抑制腫瘤新血管的形成可以控制腫瘤的生長。

以蟾蜍（Bufo）為基源的蟾皮、蟾酥和蟾衣等，作為傳統中藥，具有解毒、抗菌、增強免疫力以及抗腫瘤等多種藥理作用［3-5］，廣泛應用于多種疾病的臨床治療，包括腫瘤的治療［6-9］。由干蟾皮制成的水溶性注射液——華蟾素，具有良好的抗腫瘤效果，且已有實驗表明，其抗腫瘤的有效成分是多肽類物質［10-13］。

作者所在團隊多年來從事蟾蜍皮膚相關功能性蛋白的基因克隆研究，以分析蟾蜍皮膚中含有的多肽類有效成分［13-17］。為能更好地挖掘蟾蜍皮膚的藥用價值和新藥開發潛能，作者嘗試將中華大蟾蜍（B. gargarizans）EDF-1開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［17］亞克隆至原核表達載體誘導其重組蛋白的表達，但是未能成功。因此本研究對中華大蟾蜍EDF-1的ORF進行了密碼子優化，并委托公司合成和構建原核表達重組質粒。本文將報告通過密碼子優化構建中華大蟾蜍EDF-1原核表達載體的方法，重組蛋白的誘導表達及純化以及制備鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1的抗血清等的實驗結果，為后續研發抑制內皮細胞分化的相關制劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠和鼠飼料購于浙江省實驗動物中心，小鼠為40日齡健康的雌鼠。

1.1.2 實驗材料 大腸桿菌（E. coli）感受態細胞BL21（DE3）、PVDF膜、Protein Maker、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（Kanamysin，Kan）、小鼠抗His-tag抗體和辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠抗體購自碧云天生物技術研究所；X-tractor和BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin（鈷膠）購自Clontech公司；基因合成委托蘇州金維智生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構建 在前期工作中構建的原核表達載體不能在宿主大腸桿菌順利表達，考慮可能因密碼子的偏好性，真核細胞的密碼子在原核細胞中存在識別困難。通過E. coliCodon Usage Analysis 2.1軟件進行密碼子的偏好性分析。根據上述結果，對方琦璐等［17］克隆的中華大蟾蜍EDF-1（GenBank 登錄號K F769459）的ORF委托公司進行密碼子優化，化學合成，并連接到原核表達載體pET-28b，構建密碼子優化后的重組質粒pET-28b-EDF-1-Bufo。

1.2.2 重組蛋白的誘導表達 將重組質粒pET-28b-EDF-1-Bufo轉化至感受態細胞BL21（DE3）中，涂布于LB固體培養基（含50 mg/L Kan），37℃倒置培養12-15 h。次日，取一單菌落接種于l mL LB培養液（含50 mg/L Kan），37℃恒溫振蕩培養12-15 h。將過夜培養的菌液按l %的體積接種于LB培養液（含50 mg/L Kan），在37℃恒溫震蕩培養至OD600值0.7-1.0時，加入IPTG使其終濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L，并在30℃和37℃分別進行重組蛋白的誘導表達。每隔1 h收集一次菌液，通過離心收集菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解菌體并進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）以探索重組蛋白誘導表達的最佳條件。使用His-tag單克隆抗體進行Western-blot以確定過量表達蛋白為目的蛋白。

1.2.3 可溶性檢測及純化 按上述最佳條件，對重組中華大蟾蜍EDF-1進行大量誘導表達。在收集的0.5 mL 培養的菌體中加入 40 μL X-tractor、0.05 μL DNaseⅠ和0.5 μL 12 mg/mL溶菌酶使菌體徹底裂解，然后16 100×g離心20 min，將分離的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE。根據可溶性檢測結果，收集上清，按照鈷膠使用說明，取2 mL鈷膠（含1 mL儲存液）加入純化柱內，用平衡液（pH 8.0）置換儲存液后，加入上清使其與鈷膠混合1 h，然后用2mmol/L 咪唑溶液（pH 8.0）洗滌5次，150 mmol/L咪唑溶液（pH 8.0）洗脫，純化的重組蛋白作為制備抗血清的抗原。

1.2.4 小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清的制備及其特異性和效價檢測 將純化的重組中華大蟾蜍EDF-1（蛋白濃度約1.5 μg/L）35 mL與弗氏完全佐劑1∶1混勻，在小鼠皮下多點注射；兩周后再與弗氏不完全佐劑1∶1混勻皮下注射，該步驟每周重復一次，共免疫4次。最后一次免疫一周后心臟采血，1 500×g離心30 min，上清即小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清。抗血清的特異性通過Western-blot進行檢測。效價檢測使用間接ELISA，以純化的重組中華大蟾蜍EDF-1（2 μg/mL）為抗原，以小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清為一抗，抗血清從最低稀釋倍數1∶1000連續2倍比稀釋。顯色后，進行OD450檢測，若抗血清與陰性對照的比值（P/N）≥2.1，即判定為有效效價。

2 結果

2.1 重組質粒pET-28b-EDF-1-Bufo的獲得

根據E. coliCodon Usage Analysis 2.1軟件分析結果（圖1）顯示中華大蟾蜍EDF-1有16%密碼子在大腸桿菌中使用頻率小于10%，存在識別困難的問題。委托公司優化中華大蟾蜍EDF-1ORF 的密碼子并合成（圖2），連接至原核表達載體，最終構建pET-28b-EDF-1-Bufo重組質粒。

圖1 中華大蟾蜍EDF-1序列與大腸桿菌密碼子偏好性分析

2.2 重組中華大蟾蜍EDF-1誘導表達條件的優化

將重組質粒轉入E. coliBL21（DE3）后，使用不同的IPTG濃度、時間和溫度誘導重組中華大蟾蜍EDF-1的表達。SDS-PAGE結果（圖3）顯示，除對照組和IPTG濃度為0.001 mmol/L的樣品外，其他樣品均在20 kD附近出現明顯過量表達的蛋白，與預測的分子量19.662 kD非常接近，并且隨誘導時間的延長和IPTG濃度的增加表達量增加。為減少重組蛋白進入包涵體以及恒溫振蕩器的使用方便，選取37℃（實驗室常用）、0.01 mmol/L IPTG和誘導3 h作為最佳表達條件。

2.3 可溶性檢測

可溶性檢測（圖4）表明，重組中華大蟾蜍EDF-1蛋白主要分布于上清中，小部分分布于包涵體中。

2.4 重組目的蛋白的免疫印跡檢測

為確定過量表達重組蛋白是目的蛋白，使用His-tag抗體作為一抗實施Western-blot檢測。結果（圖5，泳道2和4）顯示，IPTG誘導的樣品在分子量20 kD附近出現明顯的信號，與SDS-PAGE結果吻合，表明該蛋白確實為目的蛋白。

圖2 中華大蟾蜍EDF-1優化前和優化后ORF堿基序列

圖3 重組中華大蟾蜍EDF-1在不同溫度、IPTG濃度、時間條件下的誘導表達

圖4 重組中華大蟾蜍EDF-1可溶性檢測

圖5 重組中華大蟾蜍EDF-1的Western-blot檢測

2.5 小鼠抗EDF-1-Bufo抗血清的特異性及其效價檢測

Western-blot檢測結果（圖6）顯示，小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1的抗血清特異性良好。檢測OD450結果（表1）顯示，抗血清稀釋倍數達到1∶8 000時，P/N值為3.1，大于2.1，稀釋倍數達到1∶16 000時，P/N值為2.01，小于2.1，故該抗血清效價為1∶8 000。

圖6 重組中華大蟾蜍EDF-1以抗血清為一抗的Westernblot檢測

表1 EDF-1-Bufo ELISA檢測效價結果

3 討論

內皮細胞是位于血管內表面的單層扁平上皮細胞，組成血管的內壁。因此，無內皮細胞的分化，就沒有新血管的形成。臨床與動物實驗證明，腫瘤的生長及演進也需要通過生成新血管為其提供所需營養［18］。沒有新生血管的營養供應，腫瘤在直徑或厚度達到1-2 mm后將不再增大，因此抑制腫瘤血管生成的研究是當前的研究熱點之一［19-20］。

EDF-1具有抑制內皮細胞分化的作用，能夠阻斷新血管生成。EDF-1不僅在人類的內皮細胞中分離得到［1］，在小鼠、壁虎中也克隆到該蛋白編碼的基因［2］。研究發現，血管的形成和血管完整性與一氧化氮（NO）在組織中的濃度息息相關，而EDF-1可以通過與細胞質中的鈣調素結合，降低一氧化氮合成酶的活性，從而減少NO的含量［21-24］。又有研究發現，EDF-1與家蠶（Bombyx mori）的MBF-1（Multiprotein Bridging Factor-1）和盤基網柄菌（Dictyostelium discoideum）早期發育相關的H7高度同源，因此有人提出，EDF-1可能是轉錄激活因子，通過結合通用轉錄因子TBP（TATA Binding Protein）調節基因的表達，進而參與內皮細胞分化的抑制，但此觀點有待進一步驗證［1，25-26］。

4 結論

本研究首次優化中華大蟾蜍EDF-1ORF的密碼子，構建其原核表達載體，明確重組中華大蟾蜍EDF-1原核表達的最佳條件，獲得特異性和效價優良的小鼠抗中華大蟾蜍重組EDF-1的抗血清，為今后對EDF-1生理功能等進一步研究奠定了良好基礎。

在中華大蟾蜍皮膚中EDF-1的發現揭示蟾蜍皮膚相關藥物中，EDF-1很可能是其中的多肽類有效成分之一。