蘇云金芽胞桿菌G03菌株的比較基因組分析

姚萌 王奎 束長龍 杜立新 李海濤 丁明月 劉榮梅

（1. 東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3. 河北農林科學院植物保護研究所，保定 071000）

作為目前研究最多、應用最廣的生防微生物，蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）廣泛分布于土壤、水體、塵埃、病死昆蟲、植被等基質中，其最大的特點是在形成芽胞的同時生成伴胞晶體，這種伴胞晶體由不同的殺蟲晶體蛋白組成（Insecticidal crystal proteins，ICPs），包括 Cry和Cyt蛋白［1］，對多種昆蟲具有特異的高效殺滅活性，如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目，及線蟲、螨類［2-7］等，并且對非靶標天敵安全、對人畜無害、不污染環(huán)境，因此Bt廣泛用于防治農、林、醫(yī)、倉貯等領域的害蟲［8］。

目前國際上Bt商品化產品約有數百種，其中用于防治鱗翅目害蟲的Bt產品主要源自庫斯塔克亞種（B. thuringiensissubsp.kurstaki，血清型H3a，3b，3c，簡稱Btk）菌株，如HD1菌株（Bt殺蟲劑Dipel的生產菌株）。該菌株已經在全世界應用幾十年，并且是目前用于評估鱗翅目害蟲特異Bt殺蟲劑毒力效價的標準參考菌株［9］。在國家有關項目的大力支持下，我國研究機構也分離出一系列對鱗翅目高毒力的Bt菌株。例如，河北農林科學院植物保護研究所分離到的鲇澤亞種（B. thuringiensissubsp.aizawai，血清型7，簡稱Bta）菌株G03，同樣對多種鱗翅目害蟲有效，中國農業(yè)科學院植物保護研究所在此基礎上構建出了同時對鱗翅目和鞘翅目（葉甲科）害蟲均具有高毒性的工程菌株G033A［10-11］，并且目前已經獲得了農藥登記證（PD20171726），商標為“禁衛(wèi)軍”。

為了進一步分析G03等鱗翅目害蟲高效菌株的特點，本研究對G03菌株進行了基因組測序，并與已公布序列的Bt生產菌株HD1以及Btk模式菌株HD73進行比較基因組的研究，相關研究結果對G03應用以及今后Bt菌株遺傳改良均具有重要的指導意義。此外，為了分析不同殺蟲活性特性Bt菌株之間的進化差異，本研究選擇了兩株蠐螬有效的菌株（Bt185、HBF18），以及對鱗翅目害蟲有效但是殺蟲活性相對較差的菌株HD12進行了基因組進化分析。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

G03菌株是實驗室保存菌株。從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載菌株 HD1、HD73，Bt185、HBF18以及HD12基因組數據用于后續(xù)分析。

1.2 方法

1.2.1 基因組制備與測序 按照張彥蕊等方法提取［12］G03菌株的基因組DNA并檢測基因組DNA的質量，合格后送交公司測序。利用TruSeq DNA無PCR文庫制備試劑盒構建測序文庫，并交由華大基因公司利用Illumina HiSeq 2500 測序平臺測序。

1.2.2 測序數據的組裝、注釋 對測序獲得的原始Reads進行質量控制，刪除低質量的Reads，利用IDBA_UD軟件包［13］對剩余高質量的pair-end clean reads數據進行基因組序列組裝。并利用NCBI 原核生物基因組注釋流程PGAP（Prokaryotic Genome Annotation Pipeline，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/）對組裝基因組數據進行基因預測與注釋。

利用泛基因組分析PGAP軟件包［14］進行基因家族聚類。利用維恩圖在線繪制網站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進行菌株間共享基因及特有基因的統(tǒng)計分析。利用Blast軟件包［15］、TBtools軟件［16］進行Go功能富集。并利用Blast軟件包［15］進行殺蟲基因及功能基因的注釋。利用MEGAX軟件包［17］和CVTree軟件包［18］分別進行蛋白質系統(tǒng)發(fā)生分析和全基因組系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結果

2.1 基因組測序、組裝與注釋

利用IDBA_UD軟件包對G03菌株進行基因組組裝。結果顯示，基因組大小為6.38 M，組裝contig數量為395，GC含量為34.71%，Contig N50為45.68 kb，Contig L50為41。相關組裝結果已經提交到NCBI GenBank數據庫，基因組登錄號為NHNQ00000000.1。進一步利用NCBI 原核生物基因組注釋流程PGAP對基因組進行了注釋，結果顯示G03菌株包含6916個基因，其中蛋白質編碼基因（Coding sequence，CDS）6 848 個。

2.2 CVTree系統(tǒng)進化分析

CVTree（Composition vector tree，簡稱 CVTree）是郝柏林研究組于2003年提出的一種全新的用于推測物種之間親緣關系與分類的研究方法［18］。這種方法基于全基因組，不需要進行序列比對，根據全基因組序列中不同核苷酸堿基或氨基酸殘基短串的出現頻率來構建系統(tǒng)發(fā)育樹。迄今為止，CVTree已經廣泛用于分析多種不同物種及數據，包括古生菌［19-20］、原核生物［18，21］、真菌［22］、病毒［23］、葉綠體序列［24］、tRNA 序列［25］、癌癥序列［26］等。

我們利用CVTree對包括G03、HD1、HD73菌株在內的7株Bt菌株的全基因組構建組分矢量并作出Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)生樹（氨基酸短串K值取6）。結果（圖1）發(fā)現，Btk菌株HD1和HD73聚在同一個分支，菌株G03與Btk菌株HD1和HD73所在分支相聚較近，屬于同一大分支。而同樣對鱗翅目害蟲有效的菌株HD12則相距較遠。此外，對鞘翅目害蟲有效的菌株Bt185與HBF18與G03所在分支也有較大的距離。

圖1 菌株CVTree系統(tǒng)進化分析樹圖

2.3 比較基因組分析

我們對CVTree分析中親緣關系較近的Bta菌株G03以及Btk菌株HD1、HD73這3株Bt菌株進行了比較基因組的分析，首先利用PGAP軟件包對其進行基因家族聚類，并利用維恩圖在線繪制網站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對這 3株菌株的共享基因及特有基因家族進行繪圖統(tǒng)計分析，如圖2所示。PGAP分析共鑒定出了6 860個基因家族，其中核心基因家族共有 4 720個（全部菌株均含有的基因家族），占全部基因家族的68.8%。而G03、HD1和HD73菌株分別有540、433和327個特有基因（僅在一株菌株中存在的基因）。G03與HD1有5122基因家族是共有的，這大于HD1與HD73共有基因家族（5101）。

2.4 菌株功能分類比較分析

我們利用Blast程序包分別將G03和HD1菌株的全部基因、共有基因以及特有基因序列與uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行序列比對，并利用TBtools軟件進行Go功能注釋以及l(fā)evel 2水平上的功能解析。圖3統(tǒng)計了菌株G03基因組Go功能注釋在level 2水平上的統(tǒng)計情況，紅色是菌株G03基因組特有基因的統(tǒng)計結果，藍色部分是G03和HD1菌株都有的基因的統(tǒng)計結果。

圖2 3株Bt菌株共享及特有基因的維恩圖分析

結果分析發(fā)現生物學途徑（biological process）相關功能部分，G03特有基因在cellular process和metabolic process兩個方面數量最多；在細胞學組件（cellular component）相關功能部分，G03特有基因在cell和cell part兩個方面數量最多；在分子功能（molecular function）方面，G03特有基因在binding和catalytic activity兩個方面數量最多。其中生物學途徑與分子功能相關的Go富集反映了G03在生物學水平與分子水平上的特點。

cellular process是指在細胞水平上發(fā)生的過程相關功能富集。例如，細胞對環(huán)境的應答過程，在該方面的功能有較多Go富集顯示菌株G03在環(huán)境適應等細胞過程方面有較多的特點。metabolic process是指生物體轉化化學物質的化學反應和途徑相關功能富集，包括合成代謝和分解代謝，這方面較多Go富集說明G03菌株在物質分解利用或化合物合成方面有較特別的能力。

Binding和catalytic activity分別指結合與催化方面的功能富集，這兩個功能是緊密相關的，G03特有基因在這兩個方面有較多的富集，顯示其在分子識別催化方面有特別的功能。

2.5 G03菌株殺蟲基因分析

我們對Bta及Btk菌株包含的殺蟲基因種類以及數量做了比較分析，HD73菌株僅有cry1Ac一個殺蟲基因，菌株G03與HD1均含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ia、cry2Ab、vip3Aa這5個高毒力殺蟲基因［3，27-29］。已有研究表明 Cry1A、Cry1I、Cry2A、Vip3A這幾類殺蟲蛋白具有不同的受體，并且殺蟲蛋白之間還有協(xié)同增效的作用，這可能是G03與HD1具有高活性的原因。此外，與HD1相比，G03菌株還含有cry1Ca、cry1Da、cry9Ea基因。

圖3 G03菌株Go功能注釋

2.6 G03、HD1菌株特有基因分析

利用基因家族分析的方法，對菌株G03與 HD1進行比較分析，結果顯示G03有597個特有基因家族，而HD1有814個特有基因家族。其中，G03菌株特有的基因家族中有232個可以注釋到功能，而HD1菌株特有的基因家族中有404個可以注釋到功能。進一步，對這些注釋到功能的基因家族進行分析，發(fā)現噬菌體與轉座酶相關的基因家族最為豐富。HD1菌株特有的基因家族中有34個基因家族與噬菌體相關，而G03菌株特有的基因家族中只有 10個與噬菌體有關。

此外，特有基因家族中，HD1菌株轉座酶基因也比較多，有26個基因家族屬于轉座酶，而G03菌株特有的基因家族中只有8個。轉座酶是轉座子執(zhí)行轉座功能的酶，通常由轉座子編碼。本研究進一步比較了兩個菌株含有轉座酶的數量與多樣性。結果顯示，G03菌株僅僅含有33個轉座酶或片段，而HD1多達216個轉座酶或片段。這些轉座酶按照序列一致性（按照序列一致性50%設定閾值）分為58個家族，其中16個基因家族是兩個菌株共有的。這些基因家族中，最大的基因家族含有45個轉座酶基因，其中有4個來源于菌株G03，41個來源于菌株HD1。該家族轉座酶含有TNP1 DDE 結構域，是 IS4、IS421、IS5377、IS427、IS402、IS1355 以及IS5等多種插入序列（Insert sequence，IS）的轉座酶。進一步用UPGMA對這些含有TNP1 DDE 結構域的轉座酶進行系統(tǒng)進化分析（去除了4個轉座酶片段），結果（圖 4）顯示這些轉座酶分為3個類群，其中類群1是兩個菌株共有的；類群2 有6個基因，是HD1特有的；類群3 只有1個基因，是G03特有的。

噬菌體與插入序列、轉座子是微生物獲得外源基因的重要途徑，同時也是微生物基因組變異的重要因素。上述分析結果表明G03含有較少的噬菌體與插入序列、轉座子相關的基因，顯示菌株G03與HD1相比，應該具有較低的變異概率。

3 討論

目前市場上常用的Bt生產菌株種類相對較少，主要以Btk菌株HD1為主，相關研究報道較多。Bta菌株G03是我國科學家自主分離并且已經用于害蟲防控的菌株，已通過基因工程改造拓展了其殺蟲譜，在鱗翅目和鞘翅目（葉甲科）害蟲防治中發(fā)揮重要作用，然而該菌株遺傳學、基因組相關研究鮮見報道。本研究利用Illumina測序技術進行了菌株G03基因組測序，并進行了基因功能注釋。在此基礎上與NCBI數據庫中已經公開的Btk生產菌株HD1、Btk模式菌株HD73、兩株蠐螬有效的菌株（Bt185、HBF18）以及含有多種殺蟲基因類型的菌株HD12進行了比較基因組研究，旨在從基因組角度分析G03等鱗翅目害蟲高效菌株的特點、比較與Btk菌株的異同，為進一步對Bt菌株進行改良、推進我國自主分離研發(fā)的Bt菌株及其殺蟲劑產品的應用奠定基礎。

圖4 含有TNP1 DDE結構域轉座酶進化關系分析。箭頭標出的是G03轉座酶

本研究首次利用基因組測序技術，從基因組水平上全面的分析了G03殺蟲相關的基因。與PCR殺蟲基因鑒定技術相比，基因組測序技術避免了PCR鑒定技術由于引物設計不全面、PCR擴增條件不合適等原因，導致基因鑒定的誤差。通過基因組分析發(fā)現，菌株G03含有8個殺蟲基因（cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry1Da、cry1Ia、cry2Ab、cry9Ea、vip3Aa），其中cry1Ca、cry1Da是菌株HD1不具備的。目前，表達Cry1A、Cry2A和Vip3A等蛋白的轉基因的抗蟲作物已經在多個國家商業(yè)化種植（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，www.isaaa.org/），使用表達與上述蛋白無交互抗性的Bt殺蟲劑在害蟲抗性治理方面具有重要的意義。利用小菜蛾抗Cry1Ac種群研究表明，Cry1Ca與Cry1Ac蛋白沒有交互抗性［30］，因此，菌株G03比HD1在害蟲的Bt殺蟲劑抗性風險控制方面更具優(yōu)勢。

Bt菌株中與殺蟲活性相關的免疫抑制因子A（Immune Inhibitor A，InhA）、 雙 效 菌 素 ZwA（Zwittermicin A，ZwA）、酰基高絲氨酸內酯水解酶（AHLs Hydrolase，aiiA）以及幾丁質酶（Chitinase）對Bt菌株殺蟲活性及環(huán)境適應性都有重要意義。InhA是Bt分泌的一種金屬蛋白酶，能夠降解昆蟲產生的抗菌肽從而逃避宿主的免疫系統(tǒng)［31-32］。aiiA可以水解細菌的群體感應相關的信號分子酰基高絲氨酸內酯（Acylated Homoserine Lactones，AHLs），對多種細菌有抑制作用，因此有助于提高Bt在昆蟲腸道內競爭優(yōu)勢［33-34］。Chitinase是一種可溶性的胞外蛋白質類殺蟲活性物質，可以幫助Bt菌株降解昆蟲腸道圍食膜中的幾丁質成分，使其能通過穿孔的腸道進入血腔引起昆蟲敗血癥，對Bt殺蟲蛋白具有增效作用［35-36］。前期研究發(fā)現，菌株G03與HD1都含inhA、aiiA、chitinase基因以及合成ZwA的基因簇，并且aiiA、chitinase基因進行系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現鱗翅目害蟲高效的菌株aiiA、chitinase基因序列比較接近，說明G03菌株在感染寄主、適應環(huán)境方面與HD1類似［37］。

此外，本研究還發(fā)現與HD1相比，G03含有較少的噬菌體與轉座子基因，說明G03基因組應該具有更好的遺傳穩(wěn)定性。作為生產菌株，遺傳穩(wěn)定性對產品發(fā)酵生產尤為重要，基因組比較分析結果顯示G03菌株在該方面更有優(yōu)勢。

綜上所述，本研究對生產菌株G03進行的基因組測序、注釋與比較基因組分析，不僅可以從殺蟲基因角度揭示生產菌株高活性的原因，還可以為進一步菌株改良提供基因組數據支撐。