乙肝病毒X蛋白和人血管生成素樣蛋白4在乙肝相關性肝癌中的表達及意義

劉凱歌 吳方雄 衛銀銀 閔亞莉 苗向霞 羅正奇

西安醫學院第一附屬醫院消化內科（西安 710077）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第六大常見腫瘤，其病死率占癌癥第二位［1］。而乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我國HCC的主要原因。研究［2］表明HBV DNA X基因編碼的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）在乙肝相關性肝癌的發生發展、侵襲及轉移中起關鍵作用。人血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）是一種分泌型糖蛋白，在脂肪和肝臟組織中分布較多［3］，研究［4-5］發現其與腫瘤的血管生成和轉移密切相關。乙肝相關性肝癌中HBx與ANGPTL4的關系如何，國內外鮮有報道。本文通過研究HBx和ANGPTL4在乙肝相關性肝癌組織中的表達及HepG2-X中ANGPTL4的蛋白水平，探討其對乙肝相關性肝癌的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料69例乙肝相關性肝癌組織標本由西安醫學院第一附屬醫院及空軍軍醫大學西京醫院病理科提供，均為2014年1月至2017年1月經手術切除病例，術前均未行放、化療及其他輔助治療。人正常肝細胞株QZG、肝癌細胞HepG2及HepG2-X為空軍軍醫大學西京醫院腫瘤生物學國家重點實驗室保存，其中HepG2-X為轉染了HBx基因的HepG2細胞。鼠抗人HBx單克隆抗體（美國NeoMarkers公司），兔抗人ANGPTL4多克隆抗體、小鼠單克隆抗體GAPDH及蛋白Marker（英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測SP法檢測按常規步驟進行，鼠抗人HBx單克隆抗體滴度1∶400，兔抗人ANGPTL4多克隆抗體滴度1∶200。以磷酸鹽緩沖液作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。每張切片隨機選擇5個視野，依據每個視野中陽性細胞百分比和染色強弱進行評分：僅對細胞核著藍色者為陰性，胞膜、胞漿或胞核呈棕黃色者為陽性。陽性細胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強陽性。兩項之和≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.2.2 細胞培養人正常肝細胞株QZG、肝癌細胞株HepG2及HepG2-X細胞培養于10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養基，置37℃、0.5%CO2培養箱常規培養。

1.2.3 Western blot檢測收集對數生長期細胞后常規裂解，收集上清，95℃蛋白變性、定量及電泳。利用SDS-PAGE分離目標蛋白。電泳后轉膜，100 g/L脫脂奶/TBS緩沖液封閉；兔抗人ANGPTL4抗體滴度1∶1 000，小鼠抗GAPDH抗體滴度1∶2 000，4℃孵育過夜；洗滌，HRP-標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，洗滌，ECL顯色，X線膠片感光。

1.3 統計學方法采用SPSS 18.0軟件處理數據，計數資料用χ2檢驗，計量資料以±s表示，兩均數比較用t檢驗，兩變量之間采用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBx和ANGPTL4在乙肝相關性肝癌組織的表達及相關性免疫組化檢測HBx和ANGPTL4在乙肝相關性肝癌組織中的表達（圖1），69例乙肝相關性肝癌組織中HBx陽性表達率為68.11%（47/69），ANGPTL4陽性表達率為63.76%（44/69）；HBx陽性組ANGPTL4的陽性表達率76.95%（36/47）明顯高于HBx陰性組ANGPTL4的陽性表達率36.35%（8/22）（P ＜ 0.05）；Spearman相關分析表明，HBx與ANGPTL4的表達呈正相關（r=0.31，P ＜0.01）。

圖1 免疫組化檢測HBx和ANGPTL4在乙肝相關性肝癌組織的表達（SP，×400）Fig.1 Expression of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinoma were detected by immunohistochemistry（SP，× 400）

2.2 乙肝相關性肝癌組織中HBx及ANGPTL4表達與肝癌臨床病理學特征的關系統計分析發現HBx及ANGPTL4在乙肝相關性肝癌組織中陽性表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、包膜浸潤無關，而與門靜脈侵襲、淋巴結轉移和TNM分期有關（P＜0.05）；其中TNM分期Ⅰ/Ⅱ期組病例中，HBx陽性表達率為60.46%（26/43），顯著低于Ⅲ/Ⅳ期組的80.76%（21/26）（P ＜ 0.05）；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期組病例中，ANGPTL4陽性表達率為58.13%（25/43），顯著低于Ⅲ/Ⅳ期組的73.07%（19/26）（P ＜ 0.05）。見表1。

2.3 Western blot結果在HepG2-X中，ANGPTL4蛋白表大水平與轉染空載體的肝癌細胞HepG2及人正常肝細胞系QZG相比顯著升高（圖2）。

3 討論

HCC是高發病率、高病死率的惡性腫瘤，但發生機制仍不明確。其發生發展是一個多階段、多因素和多分子參與的復雜過程。流行病學和分子生物學認為HBV感染是HCC發生的高危因素，其中HBV中X基因編碼的HBx被認為是乙肝相關性肝癌中重要的多功能病毒調控蛋白，通過調控基因轉錄、參與信號轉導、調控細胞增殖和凋亡在HCC的發生發展、侵襲、轉移及血管生成中發揮著重要的作用［2，6］。研究［7］發現，HBx通過激活一系列細胞內信號通路與腫瘤微環境中的肝星狀細胞、免疫細胞、炎性因子及細胞外液相互作用，促進HCC的發生進展、侵襲及轉移。HCC具有雙重血液供應系統，是典型的富血供的惡性腫瘤。它的發生、發展、轉移及復發離不開新生血管的生成。盡管目前在肝癌血管生成方面的研究取得了很大的突破，但主要針對單個血管生成相關分子的作用，沒有進行系統或網狀研究。本課題組前期工作提示HBx與HCC新生血管生成關系密切，參與的肝癌血管生成，并與多種血管生成的細胞因子相關［8-10］。本課題組前期通過基因芯片技術篩選出HBx參與肝癌血管生成的差異表達基因，發現643條差異表達基因，其中UBR3、ATXN3、ANGPTL4等19條基因經HBx干預后表達量明顯上升，FOLR1、HSPs、ZNF等624條明顯下降，提示HBx可能對ANGPTL4在肝癌血管生成中具有調節作用［10］。因此，本研究選擇二者作為研究因子。ANGPTL4屬于血管生成素樣蛋白家族一員，與腫瘤細胞的生長、遷移、浸潤和血管生成密切相關，促進癌細胞血管通道形成，為腫瘤提供血供。ANGPTL4在舌鱗狀細胞癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌及乳腺癌中的血清水平或組織表達較對照組明顯升高［11-15］。同樣在肝癌患者中，ANGPTL4 mRNA表達和蛋白水平較高，敲除或中和ANGPTL4明顯抑制肝癌MHCC-97細胞轉移，因此，ANGPTL4與肝癌的生長、轉移關系密切。

表1 HBx及ANGPTL4表達與乙肝相關性肝癌臨床病理學特征的關系Tab.1 Relationship of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinomawith clinicopathological characteristics 例

圖2 Western blot檢測人QZG肝細胞、HepG2細胞和HepG2-X細胞中ANGPTL4的表達Fig.2 The expression of ANGPTL4 in QZG，HepG2 and HepG2-X were detected by Western blot

本研究中，乙肝相關性肝癌組織中HBx陽性率為68.11%，ANGPTL4陽性率為63.76%，HBx陽性組ANGPTL4的陽性表達率明顯高于HBx陰性組ANGPTL4的表達率（P＜0.05）；相關性分析表明二者呈正相關。同時發現，HBx和ANGPTL4表達與門靜脈侵襲、淋巴結轉移和TNM分期密切相關（P＜0.05）。其中，TNM分期高的乙肝相關性肝癌中HBx和ANGPTL4的表達均較高（P＜0.05）。說明二者可能在乙肝相關性肝癌的發生、發展、轉移及血管生成中發揮著協同作用。有研究表明肝癌組織中ANGPTL4的mRNA表達和蛋白水平較高，且淋巴結轉移及腫瘤惡性度與ANGPTL4的表達密切相關［16］。而筆者通過Western blot檢測發現，HepG2-X中ANGPTL4蛋白水平較人正常肝細胞系QZG及肝癌細胞HepG2顯著升高。本課題組前期通過transwell共培養技術也發現［17］，HBx促進了ANGPTL4的表達，二者均提示在乙肝相關性肝癌的發生發展中，ANGPTL4高表達與HBx相關；HBx可能通過促進ANGPTL4的表達誘導肝癌的發生發展、侵襲及轉移，ANGPTL4高表達反映其預后不良。

因此，HBx和ANGPTL4表達上調可能是腫瘤發生發展的重要生物事件，與乙肝相關性肝癌的侵襲、轉移密切相關，二者呈正相關，HBx可能通過正向調控ANGPTL4的表達，誘導乙肝相關性肝癌的侵襲與轉移，而HBx調控ANGPTL4的具體信號通路有待進一步研究。