miR-126在子癇前期胎盤中的表達及其對血管生成的影響

李仲均 黃麗珊 蕭麗娟 李嬋 趙繼紅 黃素然

南方醫科大學附屬東莞人民醫院（廣東東莞 523059）

子癇前期是在妊娠20周后出現的以高血壓、蛋白尿、水腫為特征的妊娠期特發性疾病，是孕產婦和圍生兒死亡的重要原因。子癇前期的病因和發病機制迄今仍未完全闡明。目前研究認為，胎盤血管重鑄異常導致胎盤缺血缺氧是子癇前期發病的關鍵環節。胎盤血管重鑄過程受到多種因素的共同調節。既往的研究主要集中在sFlt1、VEGF等細胞因子表達失調方面［1］。近年來，DNA甲基化、非編碼RNA調控等表觀遺傳學變化在胎盤血管生成中的作用受到越來越多的關注［2］。miR-126屬于內源性非編碼RNA，在血管內皮細胞中表達豐富。已經有研究顯示，miR-126在子癇前期患者中呈低表達［3］，但其具體的作用尚不清楚。本研究采用實時熒光定量PCR檢測miR-126在子癇前期胎盤中的表達情況，分析其與胎盤微血管密度的相關性。利用體外細胞實驗觀察miR-126對血管內皮細胞增殖、遷移和小管形成的影響，探討其中可能的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年1月至2016年12月期間在南方醫科大學附屬東莞人民醫院婦產科住院分娩的輕度和重度子癇前期孕產婦各25例。輕度子癇前期組平均年齡（30.2±5.1）歲，平均孕周（37.8±1.2）周，重度子癇前期組平均年齡（29.7±6.7）歲，平均孕周（37.2±1.9）周。選取年齡、孕周匹配的正常妊娠孕產婦25例作為對照，平均年齡（30.5±4.8）歲，平均孕周（37.9±1.2）周。子癇前期組與正常妊娠組孕產婦年齡、孕次和孕周比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。子癇前期的診斷標準參照樂杰主編的《婦產科學》（第7版）。入選的孕產婦均無慢性高血壓、糖尿病、腎病等原發性內科疾病或其他產科并發癥。

1.2 組織樣本和細胞系孕產婦分娩后立即收集胎盤組織，從近臍帶附著處切取胎盤全層組織2塊，每個組織塊大小約為1 cm×1 cm×0.2 cm，用預冷的滅菌生理鹽水快速沖洗3次除去血污，其中一份裝入1.5 mL的EP管，置于-80℃冰箱保存；另一份組織加入10%中性福爾馬林固定24 h，梯度脫水后用石蠟包埋備用。本研究使用的組織標本通過醫院倫理委員會審核批準。人血管內皮細胞株HMEC-1購自中國科學院上海細胞庫。HMEC-1細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5%CO2及95%空氣飽和濕度條件下培養。當細胞生長達80%～90%融合后，使用胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 qRT-PCR使用RNAiso Plus提取總RNA；應用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit將miRNA逆轉錄成cDNA；應用miRcute miRNA qPCR Detection Kit進行real-time PCR。miR-126特異引物序列為5′-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3；U6特異引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；PCR反應參數為：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共35個循環。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖在不同時間點分別向每孔加入10 μL CCK-8應用液，置于細胞培養箱內避光繼續培養1 h，酶聯免疫檢測儀檢測波長為450 nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.5 細胞遷移實驗用無血清培養基制成1×105/mL的細胞懸液，以每孔100 μL接種于Transwell的上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養基，37℃培養48 h后，用棉簽擦去上室細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，100倍鏡下隨機取5個視野，計算遷移細胞平均數目。

1.6 小管形成實驗在培養板底部加入0.3 mL Matrigel，鋪平后于37℃靜置10 h。將細胞用無血清培養基制成1×105/mL的細胞懸液，以每孔100 μL接種，培養12 h，棄去舊培養液，加入含10%胎牛血清的完全培養基，繼續培養24 h。在倒置顯微鏡下觀察小管形成情況。

1.7 統計學方法統計學分析采用SPSS 17.0軟件。數據采用均數±標準差（±s）或中位數（IQR）表示。兩組間比較采用t檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-126表達及其與微血管密度的關系qRT-PCR結果顯示，miR-126在重度子癇前期組胎盤中的表達水平低輕度子癇前期組和正常妊娠組，3組間比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。重度子癇前期組胎盤微血管密度值低于輕度子癇前期組和正常妊娠組，3組間比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。胎盤組織中miR-126表達水平與微血管密度呈正相關關系（r=0.309，P=0.007）。見圖2。

圖1 miR-126在胎盤組織中的表達情況Fig.1 The expression of miR-126 in placental tissue of different groups

圖2 胎盤組織中miR-126表達量與微血管密度的相關性分析Fig.2 The correlation between miR-126 and microvascular density

2.2 miR-126對血管內皮細胞增殖能力的影響miR-126 antagomir轉染后 72、96 h，血管內皮細胞株HMEC-1生長抑制率分別為（19.65±0.17）%和（17.12±0.21）%，細胞增殖能力較對照組降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 miR-126對血管內皮細胞HMEC-1增殖的影響Fig.3 The effect of miR-126 on the proliferation of HMEC-1 cells

2.3 miR-126對血管內皮細胞遷移能力影響Transwell小室裝置檢測結果顯示，轉染miR-126 antagomir后HMEC-1細胞株的穿膜細胞數（28.33±6.51）個，明顯低于空白對照組（52.00±12.77）個和陰性對照組（48.33±14.22）個，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 miR-126對血管內皮細胞HMEC-1遷移的影響Fig.4 Detection of cell migration after transfected with miR-126 mimics in HMEC-1 cells

2.4 miR-126對血管內皮細胞小管形成的影響轉染miR-126 antagomir后HMEC-1細胞株的小管形成度［（3.83± 1.89）mm/mm2］明顯低于空白對照組［（6.17±3.25）mm/mm2］和陰性對照組［（5.97±2.95）mm/mm2］，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）。見圖5。

圖5 miR-126對血管內皮細胞HMEC-1小管形成的影響Fig.5 Analysis of effect of miR-126 on tube formation of HMEC-1 cells

3 討論

子癇前期是妊娠最常見的并發癥之一。在西方發達國家發病率約為2%～8%，在我國發病率約為9.4%～10.4%［4］。近年來，隨著我國生育政策的調整，高齡孕產婦日漸增多，子癇前期的發病率呈上升趨勢。子癇前期嚴重威脅母胎健康，是導致孕產婦和圍生兒預后不良的重要原因。在全球范圍內每年因子癇前期及相關并發癥所致的孕產婦死亡數約為5萬例，新生兒死亡數約為9萬例［5］。子癇前期發病機制復雜，涉及遺傳、免疫和環境等眾多因素的相互作用［6］。既往對子癇前期的遺傳學研究主要集中在遺傳易感性方面，近年來隨著分子生物學技術的快速發展，DNA甲基化、染色質重塑、組蛋白修飾、非編碼RNA調控等表觀遺傳學異常改變在子癇前期發病中的作用受到越來越多的關注［7-8］。miRNA是一類長19 ～ 25 nt的內源性非編碼RNA，可通過與靶基因mRNA的3′非編碼區（3′UTRs）特異性結合，誘導靶基因mRNA降解或者阻遏其轉錄后翻譯，從而調控基因表達。miRNA具有進化保守性、組織特異性、表達時序性和基因簇集性等生物學特征。目前已有多個研究發現在子癇前期孕產婦的胎盤和血清中存在多種差異化表達的miRNA。2011年，ENQUOBAHRIE等［9］利用基因芯片技術對20例子癇前期患者和20例正常孕產婦進行檢測，發現子癇前期患者的胎盤組織中存在8種異常表達的miRNA，其中miR-1、miR-139-5p、miR-1247、miR-34C-5P、miR-328、miR-500、miR-584表達下調，而miR-210表達上調。2013年，BETONI等［10］對包括自身在內的共9個獨立研究進行薈萃分析，結果顯示在子癇前期孕產婦的胎盤組織中存在至少20個異常表達的miRNA。

miR-126是一種血管內皮細胞特異性高表達的miRNA，其基因定位于人類染色體9q34.3，可由3個不同的表皮生長因子樣結構域蛋白7（epidermal growth factor like domain protein multiple 7）基因轉錄產生［11］。miR-126通過調控細胞增殖、凋亡、遷移等生物學功能，在血管新生、血管重塑和創傷修復方面發揮重要的作用。miR-126基因敲除可導致小鼠胚胎發生血管破裂、多發性出血和嚴重的系統性水腫而死亡［12］。WANG等［13］通過冠狀動脈結扎建立心肌梗死模型，發現miR-126敲除后小鼠心肌血管生成反應明顯減弱，提示miR-126對成熟個體組織的血管再生是必需的。已有研究［3］顯示，miR-126在子癇前期患者血清和胎盤組織中的表達下調。在本實驗中，筆者通過qRT-PCR和免疫組化染色技術對子癇前期和正常妊娠孕婦胎盤組織進行對比研究，驗證了miR-126子癇前期組胎盤組織中的表達水平低于正常妊娠組（P＜0.05）。此外，本研究還發現子癇前期胎盤組織中miR-126表達水平與胎盤微血管密度呈正相關（r=0.309，P=0.007），提示miR-126可能通過調控胎盤微血管生成參與子癇前期的病理過程。在體外細胞實驗中，瞬時轉染antagomir抑制HMEC-1血管內皮細胞株中miR-126的表達，發現下調miR-126表達可抑制血管內皮細胞增殖、遷移和小管形成。miRNA的生物學功能主要依賴于其作用的靶基因。miR-126可能通過靶向下調PAK1、SOX-2、VCAM-1等細胞增殖或遷移相關分子，參與血管生成［14-15］，是否存在其他途徑或分子機制仍然有待深入研究。