富氫水對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響

李翔子 孫曉宇 王贊 李志林 劉福林 周玉娟

河北大學1醫學院，2化學院（河北保定071000）；2河北大學附屬醫院（河北保定071000）

隨著現代社會人們生活習慣的改變，越來越多的疾病威脅到人們的生命安全。據世界衛生組織統計，2000-2016年間，缺血性心臟病一直居于全球十大致死原因的首位。及時的心肌再灌注是治療缺血性心臟病的有效手段，但心肌再灌注也可能對心肌造成進一步損傷，這一現象稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury）。自發現氫氣對大鼠缺血后腦梗死的治療效用以來，研究者們對氫氣進行了深入研究，發現其具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多種作用，對各種器官包括心臟缺血再灌注損傷具有很好的效果［1-3］。本研究基于NF-κB/Bcl-2信號通路，研究富氫水對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響，探討富氫水減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物為Wistar大鼠48只。雌雄各半，體質量250～280 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK-（冀）2013-1-003。實驗用富氫水為由河北大學化學院李志林老師提供（制備技術已獲得國家專利，專利號ZL102557227B）。生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液購自北京索萊寶生物科技有限公司，半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（BCL-2）、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（BAX蛋白）抗體購自Proteintech；組織蛋白提取試劑盒購自BestBio，NF-κB、二抗及β-actin購自Proteintech，預染蛋白Marker一抗稀釋液購自索萊寶；ECL化學發光液及考馬斯亮藍試劑購自Bio-Rad Laboratovies。TUNEL試劑盒購自Vazyme。氫氣測試儀購自日本TRUSTLEX。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及模型的建立［4-5］48只Wistar大鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組與富氫水組，每組24只，兩組再分別隨機分成缺血前期、缺血期、再灌注期，每期8只大鼠。麻醉采用腹腔注射方式，按大鼠體質量注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）、肝素（250 U/kg）。麻醉成功后，迅速開胸摘取心臟，立即放入4℃冰鹽水中，并輕壓心臟，排空心腔積血。進行主動脈插管并將其固定于Langendorff裝置，對照組采用預先用氧平衡（95%O2+5%CO2）的37℃K-R灌注液進行心臟灌注，富氫水組采用預先用氧平衡（95%O2+5%CO2）的37℃K-R液+富氫水灌注（0.6 mmol/L，pH7.3），兩組心臟灌注的灌注壓為7.85 kPa。按逆灌注10 min，常溫曠置20 min、再灌注20 min進行處理。完畢后，取大鼠左心室心肌約0.3 g備用。

1.2.2 指標檢測（1）TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡率：嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，于200倍熒光顯微鏡下拍照，每張切片5個不同視野，取平均值分析細胞凋亡程度。（2）免疫組織化學法檢測Caspase-3、BAX、Bcl-2表達：心肌組織用10%福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切片厚度4 μm。按試劑盒說明書操作。于200倍光鏡下照相收集圖像，每張切片隨機取5個不同視野，應用Image-pro plus（IPP）圖像分析系統進行圖像分析。（3）蛋白質印跡法檢測心肌細胞轉錄因子NF-κB蛋白的表達：大鼠取材后用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗干凈，裝入凍存管，-80℃保存備用。取0.05 g組織，勻漿后提取蛋白并定量，取總蛋白60 μg蛋白變性，標本于-20℃保存。進行15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），進行濕法轉膜。脫脂奶粉封閉2 h后，一抗孵育：TTBS稀釋好的一抗3 mL加入PVDF膜，趕走氣泡并封口，4℃搖床上過夜。洗膜，孵育二抗，再次洗膜。發光儀壓片發光。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析處理。計量數據以±s表示，組間比較用t檢驗及方差分析，進一步兩兩比較時用LSD法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 富氫水對心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響對照組與富氫水組缺血前期均未出現細胞凋亡，對照組缺血再灌注期與缺血期比較，出現明顯凋亡，細胞凋亡率明顯增高（P＜0.01），說明模型建造成功；富氫水組缺血再灌注期與缺血期比較，細胞凋亡率略高，但差異無統計學意義；富氫水組缺血期與對照組缺血期相比，無明顯差異；富氫水組缺血再灌注期與對照組缺血再灌注期相比，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01），說明富氫水可以降低細胞凋亡的發生（圖1、2）。

圖1 大鼠心肌細胞凋亡結果（×200）Fig.1 Results of cardiomyocyte apoptosis in rats（× 200）

圖2 大鼠心肌細胞凋亡結果Fig.2 Results of cardiomyocyte apoptosis in rats

2.2 富氫水對心肌組織中Bcl-2、BAX、Caspase-3蛋白表達的影響對照組缺血再灌注期與缺血期相比較，Bcl-2蛋白表達水平下降（P＜0.05），富氫水組缺血再灌注期與對照組缺血再灌注期相比較，Bcl-2蛋白表達水平增高（P ＜ 0.05）（表1，圖3）；對照組缺血再灌注期與缺血期相比較，Bax蛋白表達水平增高（P＜0.05），富氫水組缺血再灌注期與對照組缺血再灌注期相比，Bax蛋白表達水平降低（P ＜ 0.05）（表1，圖4）；對照組缺血再灌注期與缺血期相比較，Caspase-3蛋白表達水平增高（P＜0.05），富氫水組缺血再灌注期與對照組缺血再灌注期相比，Caspase-3蛋白表達水平降低（P＜0.05）（表1，圖5）。

2.3 富氫水對心肌組織中NF-κB蛋白表達的影響研究結果顯示，對照組缺血再灌注期與缺血前期、缺血期比較NF-κB蛋白含量增高（P＜0.05）；富氫水組缺血再灌注期與缺血前期、缺血期比較NF-κB蛋白含量增高（P＜0.05）；富氫水組缺血再灌注期與對照組缺血再灌注期NF-κB蛋白含量明顯降低（P＜0.01）（表2，圖6）。

3 討論

心肌缺血再灌注是治療心肌缺血的有效策略，但是標準的再灌注治療仍然會對心肌造成一定破壞。氧自由基增加、鈣超載、線粒體損傷、炎癥等是心肌缺血再灌注損傷的發生機制［6-8］。

當細胞受到某些因素刺激后啟動凋亡程序時，細胞中抑制凋亡的基因也會被激活，以維持細胞的正常結構。Caspase家族是一種內切蛋白家族，它們在控制炎癥和細胞凋亡的細胞調控網絡中提供關鍵鏈接［9］。Caspase-3是Caspase家族的關鍵性因子，是細胞凋亡發生的標志酶［10］，既是效應分子又是執行分子，其活化可激活核酸內切酶、降解DNA修復酶和細胞骨架蛋白進而導致細胞凋亡。再灌注會導致心肌自噬體增加并誘發自噬作用，激活Caspase級聯反應，氧自由基、鈣超載和m PTP開放等導致線粒體腫脹和破裂，釋放凋亡誘導因子和細胞色素C等凋亡相關蛋白，進一步啟動Caspase級聯反應，誘導心肌細胞凋亡［11］。

表1 大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達Tab.1 Expression of apoptosis related proteins Bcl-2，Bax and Caspase-3 in rat myocardium ±s，%

表1 大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達Tab.1 Expression of apoptosis related proteins Bcl-2，Bax and Caspase-3 in rat myocardium ±s，%

注：與對照組比較，*P＜0.05；與缺血期比較，△P＜0.05

組別對照組缺血前期缺血期再灌注期富氫水組缺血前期缺血期再灌注期n 8 8 8 8 8 8 Bcl-2Bax Caspase-3 0.103±0.040 14.483±2.274 6.223±1.658△0.021±0.008 6.433±2.609 29.911± 7.382△0.106±0.033 13.661±1.151 33.099±3.342△0.034±0.017 13.186±2.604 15.753±3.095*0.079±0.019 6.063±1.531 6.711±1.961*0.097±0.022 13.173±1.619 13.424±2.719*

圖3 大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白表達免疫組織化學檢測結果（×200）Fig.3 Immunohistochemical expression of Bcl-2 protein in rat cardiac myocytes（× 200）

圖4 大鼠心肌細胞Bax蛋白表達免疫組織化學檢測結果（×200）Fig.4 Immunohistochemical expression of Bax protein in rat cardiac myocytes（× 200）

圖5 大鼠心肌細胞Caspase-3蛋白表達免疫組織化學檢測結果（×200）Fig.5 Immunohistochemical expression of Caspase-3 protein in rat cardiac myocytes（× 200）

表2 富氫水對大鼠心肌中NF-κB蛋白含量（%）的影響Tab.2 Effect of hydrogen rich water on NF-κB protein content（%）in rat myocardium ±s

表2 富氫水對大鼠心肌中NF-κB蛋白含量（%）的影響Tab.2 Effect of hydrogen rich water on NF-κB protein content（%）in rat myocardium ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與缺血前期比較，△P＜0.05；與缺血期比較，▲P＜0.05

組別對照組富氫水組t值P值n 8 8缺血前期0.446±0.013 0.446±0.011 0.000 1.000缺血期0.456±0.009 0.456±0.007 0.000 1.000缺血再灌注期0.999 ± 0.012△▲0.658 ± 0.012*△▲56.574＜0.01 F值5 865.694 1 123.006 P值＜0.01＜0.01

圖6 心肌組織中HMGB1、NF-κB蛋白表達Fig.6 Expression of NF-κB protein in myocardium

Bcl-2家族是細胞凋亡的關鍵調節劑，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，這些蛋白質動態平衡的輕微變化可能導致細胞凋亡的抑制或促進。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中調控細胞凋亡的關鍵性基因，Bcl-2可以抑制細胞凋亡，拮抗促凋亡基因Bax，Bcl-2與Bax在體內構成一種均衡體系，Bax的過度表達可抑制Bcl-2的保護效應而促使細胞死亡，同時Bcl-2也可抑制Bax的表達，減少細胞凋亡［12-14］。Bcl-2與Bax互為影響，共同參與調節細胞的凋亡。同時，Bcl-2也可以抑制線粒體中促凋亡的蛋白質細胞色素c釋放到胞質，阻止胞質中的細胞色素c激活Caspase。

NF-kB是表達最廣的轉錄因子之一，介導凋亡抑制劑家族（IAP和Bcl-2）許多抗細胞凋亡蛋白的形成，是細胞凋亡的一個決定性因子，同時對免疫和炎癥過程中起重要作用的蛋白質有調節作用［15-16］。在再灌注過程中，炎癥細胞因子的產生增加，會刺激NF-κB活化。NF-κB的活化會下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進凋亡增加［17-18］。

研究發現，當Bcl-2/Bax比例升高，Caspase-3活性降低時，細胞凋亡被有效的抑制［19-22］。當NF-κB表達降低時，炎癥反應減輕，細胞凋亡減少，缺血再灌注損傷有所減輕［23-24］。本實驗結果顯示，缺血再灌注損傷后，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達水平下降，NF-κB、Bax蛋白表達水平增高，同時Caspase-3蛋白表達水平增高，細胞凋亡明顯增加。富氫水組Bcl-2蛋白表達水平增高，NF-κB、Bax蛋白表達水平降低，同時Caspase-3蛋白表達水平降低，心肌細胞凋亡水平下降。富氫水能夠通過調節NF-κB/Bcl-2信號通路，上調Bcl-2/Bax比例減少細胞凋亡，減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。

致謝：感謝河北大學附屬醫院中心試驗室提供的幫助。