克唑替尼藥物關鍵手性中間體合成進展

弓添添，肖美娟，陳 櫻，何鈺書，王 普

（浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014）

0 引言

肺癌是全世界最常見且發(fā)病率最高的惡性腫瘤。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織報道，全球范圍內每年有180萬的新發(fā)病例和160萬的死亡病例；在我國，隨著環(huán)境污染問題日益嚴重，每年新發(fā)病例為67.7萬，致死人數(shù)達56.5萬，均為世界癌癥患病率和死亡率排行榜第一[1]。肺癌分為兩類：非小細胞肺癌（NSCLC，占85%左右）和小細胞肺癌（SCLC，占15%左右）[2-4]。分子靶向藥物是目前治療非小細胞肺癌的首選藥物，相對于傳統(tǒng)的化療具有更高的選擇性，且毒副作用小[5]。

克唑替尼（Crizotinib，XalkoriR），化學名稱為3-[（R）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙氧基]-5-[1-（哌啶-4-基）-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺，結構式見圖1，相對分子質量為 450.34，分子式為C21H22Cl2FN5O，性狀為白色至淺黃色粉末[6]?？诉蛱婺嵬ㄟ^選擇性競爭三磷酸腺苷（ATP），阻斷激酶蛋白來發(fā)揮作用，使細胞停留在G1-S期，從而抑制腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡[7-8]。該藥物2011年獲美國FDA批準上市，成為全球第一個口服的EML4-ALK融合基因抑制劑，也推動了分子靶向藥物向個體化治療的發(fā)展。制備克唑替尼的難點和關鍵在于其關鍵手性中間體 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的合成。本文主要綜述了克唑替尼關鍵手性中間體 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的合成方法，包括生物酶法，化學合成法，手性拆分法，酶偶聯(lián)催化，挖掘新型酮還原酶催化以及微生物全細胞催化。

圖1 藥物克唑替尼結構式Figure 1 The structural formula of Crizotinib

1 生物酶法

Pei-Pei Kung[9]報道了以 2，6-二氯-3-氟苯乙酮（化合物1）為起始原料，通過NaBH4、甲醇還原后制得消旋體2，該消旋體2經過酯化反應得到酯類化合物3，繼而利用豬肝酯酶水解酯類化合物3得到S型和R型手性中間體4。最后將得到的R型中間體4在LiOH和甲醇體系中轉化為單一S構型的手性醇（圖2）。該方法所得產物ee值為97%，但由于生物酶不易獲得，價格昂貴，反應條件苛刻易失活，反應步驟多，周期長，收率低等限制了其進一步應用。

圖2 豬肝酯酶酶法合成（S）-醇Figure 2 Synthesis of（S）-alcohol by pig liver esterase （PLE）

2 化學合成

唐虹[10]報道了化學合成方法，以2，6-二氯-3-氟苯乙酮為起始原料，在溶劑中通過有機小分子催化劑（S）-二甲苯基脯氨醇，在還原劑金屬硼氫化鈉和三甲基氯硅烷的作用下，經不對稱還原得到（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇，收率為98%，ee值為96%，該方法克服了原有技術中采用生物酶催化步驟多，周期長和化學拆分法收率低等缺點，具有成本低、操作簡便、收率高、光學純度好等優(yōu)點，適用于大規(guī)模生產。

Qian Jian-Qiang等[11]報道了利用 Ir[（R）-DTB-spiro-PAP-3-Me]銥吡啶氨基膦化氫為催化劑，以2，6-二氯-3-氟苯乙酮為起始原料，在叔丁醇鉀，無水乙醇和氫氣體系下不對稱催化合成（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見圖 3），該方法的轉化率高，ee值為99.5%，但銥催化劑（CAS：1418483-59-6）無市售，因此限制了該合成路線的應用。

3 手性拆分

孫學英[12]等采用Boc-L-脯氨酸（N-叔丁氧基羰基-L-脯氨酸）與催化劑對甲苯磺酸和縮合劑1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽相組合的催化拆分方法制得S型產物。該路線以2，6-二氯-3-氟苯乙酮（化合物6）為起始原料，經水解制得消旋體1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（化合物7），將消旋體（化合物7）拆分為S-型醇和R-型醇（化合物8），隨后將拆分副產物混合物（化合物8，化合物9，化合物 10）水解得到S-型醇和R-型醇（化合物11），而后將R-型醇（化合物11）與三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯相組合選擇性的進行Mitsunobu反應，產物（化合物12）再經過氫氧化鈉水解，結晶分離提純制得（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見圖4），縮短了反應時間，減少了污染，易于工業(yè)化實施，但總收率較低。

圖3 金屬催化制備（S）-醇Figure 3 Synthesis of（S）-alcohol by metal as catalyst

4 酶偶聯(lián)法催化

郭紅顏等[13]利用基因工程的方法，以洛德酵母（Lodderomyces sp.）基因組為模板，經PCR擴增得到甲酸脫氫酶（FDH）基因，導入載體pET28a，構建重組質粒pFDH-pET28a，并構建乙醇脫氫酶（ADH） 表達質粒 pADH-pET21a，與 pFDH-pET28a 共 同 轉 入 E.coli BL21 （DE3）（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇（見圖 5），產物純度為100%，收率50%以上。

劉麗勤[14]構建重組大腸桿菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH，實現(xiàn)葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的共表達，進行酶偶聯(lián)轉化（圖6）。結果表明，在反應溫度為 30℃，pH=7下，（S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇的產量最高，在投料量為6%時，轉化率為93.75%。

圖4 手性拆分制備（S）-醇Figure 4 Synthesis of（S）-alcohol by chiral resolution

圖5 乙醇脫氫酶偶聯(lián)甲酸脫氫酶制備（S）-醇Figure 5 Synthesis of（S）-alcohol by coupling alcohol dehydrogenase and formate dehydrogenase

圖6 共表達乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶制備（S）-醇Figure 6 Synthesis of（S）-alcohol by coexpression of alcohol dehydrogenase and glucose dehydrogenase

5 新型酮還原酶的挖掘

魏東芝[15]以2，6二氯-3-氟苯乙酮為底物進行酶的篩選，從酶庫中篩選到可完全轉化底物且產物為S構型手性醇，ee值大于99.5%的開菲爾乳酸菌酮還原酶（KRED82，Lactobacillus）（圖 7）。當?shù)孜餄舛葹? M （621 g/L）時，反應24 h后底物轉化率可達99.5%。

圖7 利用酮還原酶合成（S）-醇Figure 7 Synthesis of（S）-alcohol by ketoreductase

6 微生物全細胞催化

筆者所在實驗室[16]篩選得到一株白地霉（Geotrichum candidum）ZJPH1704， 可用于高選擇性催化底物2，6-二氯-3-氟苯乙酮合成 （S）-1-（2，6-二氯-3-氟苯基）乙醇。底物濃度 1 g/L，200 g/L菌體量（濕重），于 40℃下反應 24 h，產率達93%，ee值大于99.9%。利用全細胞催化具有反應條件溫和，催化劑性能穩(wěn)定且不易失活，選擇性好等優(yōu)點。

7 結論與展望

近年來，隨著人們的物質生活水平快速提升，癌癥的發(fā)病率也逐年提高，肺癌作為發(fā)病率和致死率第一的癌癥，對人類的健康存在巨大威脅?？诉蛱婺崾悄壳胺切〖毎伟┑氖走x治療藥，有著較好的市場前景，因此其研究開發(fā)上市和制備技術的發(fā)展受到越來越多的關注。目前對于克唑替尼的制備技術雖然已較為成熟但仍為化學方法合成，反應過程中存在副產物多，步驟較為繁瑣，環(huán)境不友好等問題，所以在克唑替尼的制備技術開發(fā)方面仍值得研究。利用生物催化法制備克唑替尼具有高效、光學純度高、環(huán)境友好，以及其在化合物合成上能避免一些化學法所必須的苛刻條件等優(yōu)勢，使得生物催化法受到廣泛地關注，如何將生物法更好地運用于克唑替尼制備的工藝路線中是未來研究的方向。