黑青稞麩皮結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)大孔樹脂分離純化工藝優(yōu)化

楊希娟，黨 斌※，張 杰，張文剛，陳丹碩

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黑青稞麩皮結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)大孔樹脂分離純化工藝優(yōu)化

楊希娟1,2,3，黨 斌1,2,3※，張 杰1,2，張文剛1,2，陳丹碩4

（1. 青海大學農(nóng)林科學院，西寧 810016；2. 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，西寧 810016；3. 青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，西寧 810016；4. 青海省青稞資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，西寧 810016）

為了篩選對黑青稞麩皮結(jié)合酚類物質(zhì)具有良好吸附、解吸性能的樹脂，并建立其分離純化工藝，評價其體外抗氧化活性，提高黑青稞麩皮的加工利用價值。本研究通過靜態(tài)吸附和解吸試驗比較了10種大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的分離純化效果，篩選出AB-8為最佳吸附樹脂類型，其靜態(tài)吸附4 h可達到飽和；優(yōu)化的吸附和解吸工藝參數(shù)為：黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液pH值為3.0，上樣質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，上樣速度為1.5 mL/min，60%乙醇溶液作為洗脫劑進行動態(tài)洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min；優(yōu)化工藝條件下，經(jīng)LC/MS檢測，AB-8大孔樹脂能顯著提高71.43%以上不同種類單體酚的含量，且阿魏酸、丁香酸、苯甲酸、鞣花酸、楊梅素和蘆丁是純化后黑青稞麩皮結(jié)合酚中的主要酚類物質(zhì)；體外抗氧化活性表明，黑青稞麩皮結(jié)合酚粗提物和純化物均具有較強的體外抗氧化活性，純化后的黑青稞麩皮結(jié)合酚溶液清除DPPH·、ABTS·+自由基及FRAP鐵離子還原能力均顯著增強。研究結(jié)果表明AB-8大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮有較好的分離純化效果，具有潛在的工業(yè)應用前景。

糧食；酚；樹脂；黑青稞；結(jié)合酚；大孔樹脂；分離純化；抗氧化活性

0 引 言

青稞是是青藏高原最具特色的農(nóng)作物，是藏區(qū)農(nóng)牧民的主要口糧[1]，其種植面積約占青藏高原地區(qū)糧食作物的60%以上，產(chǎn)量占該地區(qū)糧食總產(chǎn)量的58%～60%[2-3]。黑色青稞是一類珍貴的青稞種質(zhì)資源[4-5]。在青藏高原區(qū)域，由于其含有豐富的營養(yǎng)及功能化學成分而受到人們的關(guān)注，被開發(fā)各種類型的食品。但是在其產(chǎn)品的加工利用過程中，大部分僅僅利用了黑青稞的面粉部分，造成了大量麩皮的產(chǎn)生和浪費。青稞麩皮中富含多種酚類化合物，如酚酸、黃酮、花青素等[6]。大量研究證明，谷物中的酚類化合物作為重要的膳食抗氧化組分，對預防人類機體氧化應激和心血管疾病具有突出的防護作用[7-8]。但是關(guān)于黑青稞中多酚的相關(guān)研究還非常有限。

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合（與多糖或蛋白通過酯鍵和醚鍵）的形式存在[9-10]。在谷物中主要以結(jié)合態(tài)存在形式為主，且80%以上存在于谷物的麩皮和胚乳中[11-12]。結(jié)合酚是黑青稞中的主要酚類物質(zhì)存在形式[13]，但是關(guān)于黑青稞結(jié)合酚的相關(guān)研究較少。當前大部分研究多關(guān)注的是青稞中游離酚的提取、純化、含量及抗氧化活性測定[14-15]，從而忽略了其結(jié)合酚的相關(guān)研究。雖然目前已有學者研究了青稞中結(jié)合酚的提取方法及酚類物質(zhì)組成與含量[13,16]，但是還未見關(guān)于黑青稞結(jié)合酚分離純化方面的相關(guān)報道。現(xiàn)已證明植物多酚具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能[17-19]，但是由于溶劑提取法提取的青稞結(jié)合酚粗提液中雜質(zhì)較多，會對其多酚含量及其活性評價造成干擾，因此有必要對其結(jié)合酚粗提液進行純化，去除蛋白質(zhì)和糖分等雜質(zhì)，從而得到純度更高的結(jié)合酚類物質(zhì)，科學地評價黑青稞結(jié)合酚的生物活性。

大孔吸附樹脂是一種性質(zhì)穩(wěn)定的高分子材料，具有良好選擇性、吸附性和易于再生等優(yōu)點，且不會受到酸堿和有機溶劑的影響，從而被廣泛用于然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離純化[20]。不同類型大孔樹脂對總酚和總黃酮等酚類物質(zhì)的分離效果比較已在短葶飛蓬[21]、魚腥草[22]、沙棗[23]、金錢柳葉[24]、苦蕎[25]、荔枝果肉[26]等植物中進行了相關(guān)報道。但是不同植物來源提取物由于所含酚類物質(zhì)不同，因此適合其分離的樹脂差異也很大。而關(guān)于黑青稞中結(jié)合酚分離純化的研究還未見報道。我們前期試驗結(jié)果證明了黑青稞麩皮中提取的游離酚得率為0.18%，而結(jié)合酚得率為2.40%。因此，對黑青稞結(jié)合酚進行分離純化的研究有望提高黑青稞麩皮的加工利用率和附加值。因此本文研究以黑青稞麩皮粗提物為原料，通過比較 10 種不同類型大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的吸附和解吸效果，篩選對黑青稞麩皮結(jié)合酚類物質(zhì)具有良好吸附、解吸性能的樹脂，并優(yōu)化分離工藝參數(shù)，建立其分離純化工藝，評價其體外抗氧化活性，旨在為提高黑青稞麩皮的加工利用率和附加值提供理論科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

黑青稞麩皮（結(jié)合酚含量質(zhì)量分數(shù)279.66 mg/100 g，總酚質(zhì)量分數(shù)為470.57 mg/100 g，以沒食子酸質(zhì)量表示；結(jié)合黃酮質(zhì)量分數(shù)29.59 mg/100 g，總黃酮質(zhì)量分數(shù)為53.57 mg/100 g，以蘆丁質(zhì)量表示；結(jié)合酚類物質(zhì)的得率為2.40 %），黑青稞為青海省農(nóng)林科學院作物育種栽培研究所青稞研究室培育的947品系。該材料于2016年3月至8月在青海省農(nóng)林科學院試驗田（西寧）種植。樣品收獲后脫粒，室溫晾干，去除顆粒石子。用實驗室小型磨粉機磨粉后進行麩皮和面粉的分離，收集麩皮為本試驗所用。

大孔樹脂：NKA-9、NKA-2、HPD-826、HPD-100、H1020、D101、X-5、AB-8型大孔樹脂均購自北京索萊寶科技有限公司；DA201-C、S-8型大孔樹脂購自鄭州華溢科技新材料股份有限公司。不同型號樹脂的物理性質(zhì)如表1所示。

表1 10種大孔樹脂的物理參數(shù)

試劑：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、TPTZ（三吡啶三吖嗪）、Trolox（水溶性維生素E）、ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]，Sigma公司；沒食子酸、根皮酚、原兒茶酸、綠原酸、兒茶酸、2,4-二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、蘆丁、阿魏酸、水楊酸、咖啡酸、鞣花酸、原花青素A2、原花青素B2、柚皮苷、橙皮苷、苯甲酸、鄰香豆酸、楊梅素、槲皮素、藜蘆酸、柚皮素、山柰酚標準品（純度≥98.0%），上海源葉生物科技有限公司；福林酚（優(yōu)級純），北京索萊寶科技有限公司；丙酮、乙醇、甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸均為市售分析純。

1.1.2 試驗儀器

CD1型法國雷諾肖邦磨粉機（法國肖邦科技公司）；AL204萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；DKB-600B型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；Retavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布奇有限公司）；N4S紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；Christ ALPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機（德國Christ有限公司）； SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； SHA-C 恒溫振蕩器（常州國華儀器有限公司）；層析柱（規(guī)格直徑1.6×20 cm）（上海滬西分析儀器廠有限公司）；HL-2D定時數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；DBS-100電腦全自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）。Q-Exactive高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Fisher美國賽默飛世爾科技公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞麩皮結(jié)合酚提取

參考文獻方法[16]，將提取青稞游離酚后的殘渣采用酸法對其進行處理，乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取相，在45 ℃條件下真空濃縮至浸膏狀，得青稞結(jié)合酚粗提液，于-20 ℃避光保存以備用。

1.2.2 總酚、總黃酮的測定

純化過程中青稞結(jié)合酚總酚含量測定采用Folin- Ciocalteu法，以沒食子酸為標準品，總酚含量以每100 g提取物（干基）中所含相當于沒食子酸的質(zhì)量表示[16]；總黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法，以蘆丁為標準品，總黃酮含量以每100 g提取物（干基）中所含相當于蘆丁的質(zhì)量表示[27]。

1.2.3 大孔樹脂純化黑青稞麩皮結(jié)合酚的條件優(yōu)化

1）樹脂預處理

分別稱取適量型號為 NKA-9、NKA-2、HPD-826、HPD-100、H1020、D101、DA201-C、S-8、X-5、AB-8的大孔樹脂按照文獻方法[28]進行預處理，以除去制備和貯存中殘留的雜質(zhì)。

2）最佳樹脂類型的篩選

吸附率的計算：稱取經(jīng)預處理的濕樹脂NKA-9、NKA-2、HPD-826、HPD-100、H1020、D101、DA201-C、S-8、X-5、AB-8各0.5 g，按照編號依次加入100 mL三角瓶中，加入一定濃度樣品液50 mL于各三角瓶，置恒溫水浴震蕩器中，25℃，120 r/min恒溫振蕩24 h后抽濾，取濾液測定青稞總酚含量[26]。根據(jù)公式（1）計算樹脂吸附率。

式中為吸附率，%；0吸附前溶液初始多酚濃度，mg/mL；1吸附后溶液剩余多酚質(zhì)量濃度mg/mL。

解吸率計算：用蒸餾水清洗2次樹脂，用濾紙吸干樹脂表面水分，轉(zhuǎn)入100 mL三角瓶中，加入95%的乙醇50 mL，于25℃下恒溫振蕩解吸12 h（120 r/min），取上清液測定總酚含量[29-30]。根據(jù)公式（1）計算樹脂解吸率（）。

式中為解析率，%；2解析后溶液中總酚含量，mg/mL；1吸附溶液體積，mL；2解析溶液體積，mL。

3）青稞結(jié)合酚大孔樹脂靜態(tài)吸附解吸動力學曲線

參考文獻方法[31]稱取已篩選的濕樹脂1 g，加入50 mL青稞結(jié)合酚粗提液于各三角瓶，在25 ℃，120 r/min下恒溫振蕩24 h，每隔1 h吸取上清液0.5 mL測定多酚質(zhì)量濃度。分別以時間和吸附率為橫縱坐標，繪制靜態(tài)吸附曲線。

將吸附飽和樹脂用蒸餾水清洗2 次，用濾紙吸干樹脂表面水分，加入95%的乙醇50 mL于三角瓶中，于25 ℃，120 r/min下恒溫振蕩解吸12 h，每隔1 h吸取上清液0.5 mL測定多酚質(zhì)量濃度。分別以時間和解吸率為橫縱坐標，繪制靜態(tài)解吸曲線。

4）pH值對青稞結(jié)合酚吸附效果的影響

分別稱取5份0.5 g AB-8樹脂，預處理后，分別裝入5個50 mL的三角瓶中，取青稞結(jié)合酚粗提液10 mL于各瓶中，用0.01 mol/mL的NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)青稞結(jié)合酚提取液的pH值至2、3、4、5、6、7，25 ℃下120 r/min恒溫振蕩12 h，測量青稞多酚的質(zhì)量濃度，計算吸附率。

5）上樣液質(zhì)量濃度優(yōu)化

分別稱取4份0.5 g AB-8樹脂，預處理后，分別裝入4個50 mL的三角瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.25 mg/mL的青稞結(jié)合酚粗提液，25 ℃，120 r/min恒溫振蕩12 h，測定多酚質(zhì)量濃度，計算樹脂對多酚的吸附率。

6）洗脫劑種類優(yōu)化

稱取4份0.5 g AB-8樹脂，經(jīng)預處理，分別裝入50 mL三角瓶中，分別加入青稞結(jié)合酚粗提液 10 mL于各瓶中，25 ℃，120 r/min恒溫振蕩12 h，測定其多酚質(zhì)量濃度。用蒸餾水沖洗吸附飽和的樹脂至表面無醇味溢出，用濾紙吸干表面水分，裝入三角瓶中，分別加入體積分數(shù)70%的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯各25 mL，25 ℃，120 r/min恒溫振蕩12 h，測定解析液中多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

7）洗脫劑體積分數(shù)優(yōu)化

先利用AB-8樹脂充分吸附青稞結(jié)合酚提取液，然后取出吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗樹脂至表面無醇味，用濾紙吸干樹脂表面水分后轉(zhuǎn)入瓶中，分別加入體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液25 mL，25 ℃，120 r/min恒溫振蕩12 h，測量解析液中多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

8）上樣速度優(yōu)化

稱取15 g AB-8樹脂，預處理后，濕法裝柱（柱長200 mm，內(nèi)徑16 mm）。經(jīng)蒸餾水平衡后分別用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min流速上柱吸附，收集流出液，測定多酚質(zhì)量濃度，計算其吸附率。

9）洗脫劑洗脫流速對青稞結(jié)合酚解吸率的影響

將15 g AB-8樹脂預處理后，加入一定體積的青稞結(jié)合酚溶液，充分震蕩吸附12 h后濕法裝柱（柱長200 mm，內(nèi)徑16 mm），先用約2倍柱體積（bed volume）的蒸餾水沖洗樹脂，去除吸附在樹脂表面的溶液，再用60%乙醇溶液分別以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min流速洗脫，收集不同流速下的洗脫液，測其多酚質(zhì)量濃度并計算其解吸率。

1.2.4 純化后青稞結(jié)合酚提取液單體酚組成及含量high performance liquid chromatography/mass spectrum (HPLC/MS)分析

1）色譜條件

將純化后的游離酚配制成濃度為1 mg/mL的溶液，用0.45m濾膜過濾，LC-MS檢測分析。色譜條件為：Dionex Ultimate 3000 RSLC 色譜系統(tǒng)；Hypersil GOLD Aq，100 mm×2.1 mm，1.9m色譜柱；流動相A：0.9%乙酸水溶液，流動相B：甲醇溶液；梯度洗脫條件（0 min，流動相A 98%/流動相B 2%；2 min，流動相A 95%/流動相B 5%；5 min，流動相A 80 % /流動相B 20%；8 min，流動相A 20%/流動相B 80%; 9～10 min，流動相B 100%；11～12 min，流動相A 98%/流動相B 2%）；流速0.3L/min；進樣量3L。

2）質(zhì)譜分析條件

選用Thermo Q-Exactive 質(zhì)譜系統(tǒng)，負離子測定模式，噴霧電壓設定為2.8 kV，護套氣體流量：22 arbitrary units，輔助氣體流量：2 arbitrary units，毛細管溫度：300 ℃，加熱器溫度：300 ℃，掃描模式：全掃描（分辨率70 000），掃描范圍100～1 500 m/z。

1.2.5 青稞純化后結(jié)合酚體外抗氧化試驗

DPPH·自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS·+ 自由基清除能力均參考Yang等[27]的方法。DPPH清除能力以Trolox為標準物，517 nm處測吸光值，繪制標準曲線并進行回歸處理，得回歸標準曲線方程為=-0.004 2+0.916 3（0～140mol/L，2=0.992 8）。樣品的DPPH·清除能力以每100 g提取物（干基）中所含 相當于水溶性維生素E當量（mol / 100 g ）表示,下同。

FRAP抗氧化能力以Trolox作為標準品，在波長593 nm下測定吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程：=0.007 2-0.001 2（0～300mol/L，2=0.999 2）。樣品的 FRAP抗氧化能力以以每100 g提取物（干基）中所含相當于水溶性維生素E當量（mol /100 g ）表示。

ABTS·+清除能力以Trolox為標準物，734處測吸光值，繪制標準曲線并進行回歸處理，得回歸標準曲線方程為=-0.001+0.624 2（0~300mol/L，2=0.990 7）。樣品的ABTS·+清除能力以每100 g提取物（干基）中所含相當于水溶性維生素E當量（mol /100 g）表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果以平均值±標準差（±SD）表示，作3次重復。方差分析（ANOVA）和顯著性檢驗用SPSS21.0軟件進行SNK-q處理。平均值間的統(tǒng)計顯著性為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑青稞麩皮結(jié)合酚大孔吸附樹脂的篩選

大孔樹脂的吸附與解吸特性不僅與其自身三維結(jié)構(gòu)（如比表面積、孔徑和孔容積等）密切相關(guān)，還與被吸附物質(zhì)的極性和分子大小有關(guān)[32]。從表2看出，DA201-C 與H1020樹脂對黑青稞麩皮總酚的靜態(tài)吸附率在參試的10種大孔樹脂中最高,分別為87.07%和86.98%，且兩者無顯著差異，其次為AB-8和S-8類型樹脂；黑青稞麩皮總酚解析率最高的樹脂型號為AB-8（93.72%），其顯著高于其他參試樹脂類型，其次為X-5和NKA-2。10種大孔樹脂對黑青稞麩皮總黃酮的靜態(tài)吸附試驗中，NKA-9的吸附率最高（86.00%），其次為AB-8（74.01%）和NKA-2（73.71%）；總黃酮的解析率試驗中，X-5（96.60%）和HPD100（93.50%）的解析率最高，且兩者之間無顯著差異，其次為S-8（87.22%）和AB-8（75.67%）。此研究結(jié)果說明大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚類物質(zhì)的吸附存在一定的選擇性，這與紅小豆[28]及玫瑰果[30]多酚的研究結(jié)果一致。因此綜合考慮大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中總酚和總黃酮的吸附率和解吸率結(jié)果，發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂對黑青稞麩皮中總酚及總黃酮均具有較高的吸附能力，且對總酚的解析率最高，對總黃酮的解析率較高，因此本試驗選用對黑青稞麩皮結(jié)合型總酚及總黃酮吸附和解吸性能均較好的大孔樹脂AB-8進行吸附動力學研究。

表2 不同極性大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物總酚和總黃酮靜態(tài)吸附率與解吸率比較

注：結(jié)果以平均值±標準差（=3）來表示。采用 Duncan 分析，以不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）。

Note:Results are mean±SD (=3). Numbers followed by different letters are significantly different at the level of<0.05 according to Duncan test.

2.2 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附、解析分析

從圖1可以看出，AB-8樹脂對于黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中總酚和總黃酮的吸附率均隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢，4 h后，AB-8樹脂對總酚（61.79%）和總黃酮（58.50%）的吸附率基本達到飽和，所以AB-8樹脂的靜態(tài)吸附時間為4 h。5 h時，AB-8樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中總酚和總黃酮的解吸率均達到飽和，其后隨著解吸時間的延長，解吸率呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢。因此AB-8樹脂靜態(tài)解吸時間為5 h。

圖1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸曲線

2.3 AB-8樹脂純化黑青稞麩皮結(jié)合酚的條件優(yōu)化

2.3.1 pH值對樹脂吸附效果的影響

pH值對AB-8樹脂吸附黑青稞麩皮青稞結(jié)合酚的影響見圖2。如圖2所示，隨著pH值的增加，總酚及總黃酮吸附率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH值為3時吸附率最高，總酚和總黃酮的吸附率分別達到78.61%和69.32%。所以選擇3作為樹脂最適的pH值。

圖2 pH值對AB-8樹脂吸附效果的影響

2.3.2 上樣液質(zhì)量濃度對樹脂吸附效果的影響

上樣液質(zhì)量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響如圖3所示。隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢，在質(zhì)量濃度達到1.5 mg/mL時，AB-8樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚（72.37%）及總黃酮（68.65%）的吸附率達到最大，超過1.5 mg/mL時，樹脂的吸附率趨于穩(wěn)定，所以選擇1.5 mg/mL為最適的質(zhì)量濃度。

2.3.3 洗脫劑種類對樹脂靜態(tài)解吸率的影響

如圖4所示，不同種類洗脫溶劑顯著影響AB-8樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚及總黃酮的解吸率（<0.05）。甲醇對黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液中總酚的解吸率最高，其次為乙醇，但是乙醇對總黃酮的解析率最高，其次為甲醇。由于青稞結(jié)合酚中多酚與黃酮的極性不同，因此不同洗脫溶劑對其的解吸效果有差異。綜合考慮到乙醇的安全性，故最終選擇乙醇作為適宜的洗脫劑。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對AB-8樹脂吸附效果的影響

圖4 洗脫劑種類對AB-8樹脂靜態(tài)解吸率的影響

2.3.4 洗脫劑體積分數(shù)對樹脂靜態(tài)解吸率的影響

如圖5所示，當乙醇體積分數(shù)小于60%時，AB-8樹脂的解吸率隨著乙醇體積分數(shù)的增加而逐漸增大。當乙醇體積分數(shù)達到60%時，樹脂對黑青稞麩皮中總酚和總黃酮的解吸率均達到最高，分別為76.99%和89.82%；之后隨著乙醇體積分數(shù)的增加，其解吸率反而下降。多酚通過與樹脂間形成氫鍵從而被吸附，乙醇體積分數(shù)增大，有利于對氫鍵的破壞，使更多的多酚類物質(zhì)被洗脫下來[31]。但是醇體積分數(shù)的增加會減少其中的水分含量，從而導致一些水溶性多酚類物質(zhì)不能被溶解[31]，從而降低了樹脂的解吸率。因此60%的乙醇溶液為黑青稞麩皮多酚類物質(zhì)的最佳解吸劑。

圖5 洗脫劑體積分數(shù)對AB-8樹脂靜態(tài)解吸率的影響

2.3.5 上樣速度對樹脂吸附率的影響

動態(tài)吸附時，樣品的上樣速度影響大孔樹脂對青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的吸附效果。如圖6所示，上樣速度小于1.5 mL/min時，酚類物質(zhì)分子與大孔樹脂可以充分接觸，樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚的總酚吸附率較高。上樣速度較大時，酚類分子還未來得及充分與樹脂接觸吸附，就已經(jīng)通過了樹脂，從而降低了樹脂的吸附率[28]；當上樣速度小于1.0 mL/min時，樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚的總黃酮吸附率達到最高（83.75%），其后隨著上樣速度的增加，樹脂的吸附率下降。考慮到上樣速度過慢會延長工作時間，從而增加成本，且樹脂對總黃酮的吸附率在上樣速度為1.0（83.75%）和1.5 mL/min（79.15%）時差異不顯著（>0.05），因此本試驗選擇黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液的上樣速度為1.5 mL/min。

2.3.6 洗脫劑洗脫流速對樹脂動態(tài)解吸率的影響

用不同流速的60%乙醇溶液洗脫被樹脂吸附的黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的結(jié)果如圖7所示，當洗脫流速為1.5 mL/min時，樹脂對總酚（80.94%）和總黃酮（89.84%）的解吸率均達到最高；當洗脫流速超過1.5 mL/min時，隨著洗脫劑流速的增加，樹脂的解吸率出現(xiàn)下降。這主要是因為洗脫流速較慢時，解吸液與樹脂接觸充分，能夠更好地破壞氫鍵，使多酚類物質(zhì)被解吸出來。相反，由于洗脫流速的加快使得洗脫液與樹脂接觸的時間縮短，從而一部分多酚類物質(zhì)來不能被及時解吸出來，降低了樹脂的解吸率[31]。因此本試驗選擇1.5 mL/min做為洗脫流速。

圖6 上樣速度對AB-8樹脂動態(tài)吸附效果的影響

圖7 60%乙醇洗脫流速對AB-8樹脂動態(tài)吸附效果的影響

2.4 黑青稞麩皮結(jié)合酚單體組成分析

本研究黑青稞麩皮結(jié)合酚中共檢測了21種單體酚類物質(zhì)，單體酚種類及純化前后的質(zhì)量分數(shù)見表3。AB-8大孔樹脂能很好地分離純化黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中酚類物質(zhì)，純化前檢測到18種單體酚化合物，純化后檢測到20種單體酚化合物。其中沒食子酸、原兒茶酸、2,4-二羥基苯甲酸只在純化后的黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中檢測到，水楊酸和山奈酚經(jīng)過樹脂純化后未檢測到。不同的單體酚種類由于其極性及結(jié)構(gòu)的不同，其用于酚類物質(zhì)分離純化最適的大孔樹脂種類和極性差異也較大。因此要選擇適宜于多種單體酚分離的大孔樹脂種類也較難。現(xiàn)已有文獻報道了云南黑青稞多酚的純化工藝[33]，確定了HPD-826樹脂為青稞多酚純化最適大孔樹脂，該研究中黑青稞多酚是采用溶劑提取的游離型多酚，與本研究中篩選的AB-8樹脂作為黑青稞結(jié)合酚純化的最佳樹脂的結(jié)果不同。說明黑青稞中游離酚與結(jié)合酚的組成及含量的差異導致了其篩選的適宜樹脂類型有本質(zhì)的區(qū)別，對比前人研究結(jié)果，黑青稞中游離酚適合非極性樹脂純化，而結(jié)合酚適合弱極性樹脂純化。

表3 AB-8大孔樹脂純化前后黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液中單體酚種類及質(zhì)量分數(shù)

注：nd 表示未檢出。

Note：nd, not detected.

本試驗中選擇的AB-8樹脂純化黑青稞麩皮結(jié)合酚，其中丁香酸、對香豆酸、苯甲酸、鄰香豆酸、藜蘆酸在純化后含量顯著降低（<0.05），其余單體酚酸含量均顯著增加，尤其是檢測的8種單體黃酮的含量均顯著高于純化前的含量（<0.05）。其中阿魏酸的含量提高了141倍以上，成為黑青稞麩皮結(jié)合酚的主要酚酸，這與Zielinski[34]報道的阿魏酸是大麥中主要酚酸的結(jié)果一致。說明AB-8大孔樹脂對黑青稞麩皮中的結(jié)合酚有較好的的分離純化效果，能保留和提高黑青稞麩皮結(jié)合酚中71.43%以上不同種類單體酚的含量。

此外，本試驗發(fā)現(xiàn)純化后黑青稞麩皮結(jié)合酚中阿魏酸、丁香酸、苯甲酸、鞣花酸、楊梅素和蘆丁六者合計占總酚的82.44%（3210.25/3893.81），因此這6種物質(zhì)是純化后黑青稞麩皮結(jié)合酚中的主要酚類物質(zhì)。這與Yang等[27]報道的沒食子酸、丁香酸、4-香豆酸、苯甲酸、藜蘆酸、柚皮素、橙皮苷、槲皮素、蘆丁是藍粒青稞結(jié)合酚主要酚類物質(zhì)的結(jié)果不同，說明不同顏色的青稞中其多酚組成及含量有差異，且首次在黑青稞結(jié)合酚中發(fā)現(xiàn)含有豐富的鞣花酸。但是本研究只是初步通過有限的標準品鑒定出黑青稞麩皮結(jié)合酚的酚類物質(zhì)組成及含量，由于青稞麩皮結(jié)合酚提取物中酚類物質(zhì)種類較多且成分復雜因此其酚類化合物的鑒定還需要進一步純化制備出單體組分，通過核磁等手段確證。本研究的結(jié)果可為下一步的純化和鑒定提供分離條件的選擇和結(jié)構(gòu)解析的參考。

2.5 抗氧化活性測定

以往研究多是關(guān)注青稞粗提液的抗氧化活性，因其所含雜質(zhì)較多而影響了對其抗氧化活性的評價。而本研究測定了純化后的黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物的抗氧化能力，對于評價黑青稞麩皮結(jié)合酚的抗氧化能力更具有科學性。由表4可以看出，黑青稞麩皮結(jié)合酚粗提物具有較強的抗氧化活性，其抗氧化活性高于Yang等[27]報道的藍粒青稞結(jié)合酚的抗氧化活性。經(jīng)AB-8大孔樹脂分離純化后，黑青稞麩皮結(jié)合酚溶液的DPPH·、ABTS·+自由基清除能力及FRAP鐵離子還原能力均顯著提高，分別為純化前的2.03、19.49及2.25倍。表明AB-8大孔樹脂較適用于黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物中多酚類物質(zhì)的分離純化。因此本研究結(jié)果可為黑青稞麩皮中結(jié)合酚的進一步利用提供理論依據(jù)。

表4 AB-8大孔樹脂純化前后黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液抗氧化活性比較

3 結(jié) 論

1）通過靜態(tài)吸附和解吸試驗比較了NKA-9、NKA-2、HPD-826、HPD-100、H1020、D101、X-5、AB-8等10種大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的分離純化效果，從中篩選出AB-8為最佳吸附樹脂類型。該樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚提取物具有良好的吸附和解吸性能。

2）通過靜態(tài)和動態(tài)吸附及解析級試驗得到AB-8大孔樹脂對黑青稞麩皮結(jié)合酚中總酚和總黃酮的最佳吸附和解析工藝條件為：黑青稞麩皮結(jié)合酚提取液調(diào)整pH值為3，上樣質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，上樣速度為1.5 mL/min，60%乙醇溶液作為洗脫劑進行動態(tài)洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min。

3）經(jīng)LC/MS分析，AB-8大孔樹脂在最優(yōu)工藝條件下分離純化的黑青稞麩皮結(jié)合酚中能檢測到更多的單體酚種類，且能顯著提高其中71.43%以上不同種類單體酚的含量。阿魏酸、丁香酸、苯甲酸、鞣花酸、楊梅素和蘆丁是純化后黑青稞麩皮結(jié)合酚中的主要酚類物質(zhì)。

4）黑青稞麩皮結(jié)合酚粗提物和純化物均具有較強的體外抗氧化活性，經(jīng)AB-8大孔樹脂分離純化后，黑青稞麩皮結(jié)合酚溶液的DPPH·、ABTS·+自由基清除能力及FRAP鐵離子還原能力均顯著增強。AB-8大孔樹脂分離黑青稞麩皮結(jié)合酚類物質(zhì)是可行的，且具有潛在的工業(yè)應用前景。

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Process optimization on separation and purification of bound polyphenol in black highland barley bran by macroporous resin

Yang Xijuan1,2,3, Dang Bin1,2,3※, Zhang Jie1,2, Zhang Wengang1,2, Chen Danshuo4

(1.810016,; 2.810016,; 3.810016,; 4.810016,)

Highland barley grows in the Qinghai-Tibet Plateau at an elevation of 1 400～4 700 m, and it is the major crop in the Qinghai-Tibet Plateau region, as well as the main food for farmers and herdsmen in Tibetan areas for sustenance. Black highland barley is a precious germplasm resource. Black highland barley has attracted extensive attention due to its rich nutrition and functional chemical components in the Qinghai-Tibet Plateau region. It has been developed into various types of food. But in the process of black highland barley, lots of brans were produced and wasted. The black barley bran is rich in phenolic compounds including phenolic acids and flavonoids. At present, most of the reports on polyphenols in black highland barley have been about free phenolics. There are few reports about bound phenolics. There have been no reports regarding research on separation and purification of bound phenolic compounds and their antioxidant activities in black highland barley bran from the Qinghai-Tibet Plateau region. This paper focuses on the separation and purification technology of bound polyphenols in barley highland bran and its antioxidant activity. The aim of this study was selecting a resin which has a good adsorption and desorption performance of phenols of black highland barley bran, optimizing the separation process parameters and evaluating its antioxidant activity in vitro, thus improving value of processing and utilization about black highland barley barley bran. The separation and purification process of black highland barley barley bran polyphenol was established by macroporous resin. The static adsorption and desorption performance of ten different polarities macroporous resins (NKA-9, NKA-2, HPD-826, HPD-100, H1020, D101, X-5 and AB-8) to total phenolics and flavonoids of black highland barley barley bran bound extraction were compared to select suitable resin for purification of phenolic compounds. AB-8 macroporous resin exhibited the best capability of adsorption and desorption of total phenolics and total flavonoids in black highland barley bran, it was selected as the best adsorption resin type of separation and purification of bound phenolics. And the macroporous resin reached equilibrium within 4 h. The optimum conditions for adsorption and desorption of bound phenolics were as following: pH value of black highland barley bran bound phenolic extract was adjustment to 3.0, sample concentration was 1.5 mg/mL, the polyphenol was passed through the AB-8 resin at a flow rate of 1.5 mL/min, followed by desorption with 60% ethanol at a flow rate of 1.5 mL/min. Under optimum technology conditions, Ab-8 macroporous resin could significantly increase the content of over 71.43% individual phenolics, the most abundant bound phenolics were ferulic acid, syringic acid, benzoic acid, ellagic acid, myricetin and rutin in the purified black highland barley bran. Among the three antioxidant systems, the crude and purified extracts of bound polyphenols in black highland barley bran both showed a relatively higher capacity to scavenge DPPH×and ABTS×+. It also had a relatively stronger ferric reducing antioxidant power (FRAP). But the antioxidant capacity of the purified bound polyphenol performed was better than crude sample on this study. In conclusion, AB-8 macroporous resin could be applied to purify total phenolics and total flavonoids of bound polyphenol in litchi pulp black highland barley bran. It has potential industrial application prospect.

grain; polyphenols; resins; black highland barley; bound polyphenol; macroporous resin; separation and purification; antioxidant activity

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.037

TS255.1

A

1002-6819(2018)-21-0295-09

2018-07-08

2018-09-14

青海省科技廳應用基礎(chǔ)項目（2016-ZJ-711）；北京大學翁洪武科研原創(chuàng)基金（2018年度）；青海省重點實驗室科技創(chuàng)新平臺建設項目（1-6）；青海省“高端創(chuàng)新人才千人計劃”（2016年度）；青海省第二批“135”高層次人才培養(yǎng)計劃（2017年度）

楊希娟，副研究員，博士生，主要從事食品功能化學與營養(yǎng)方面的研究。Email：156044169@qq.com

黨 斌，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工方面的研究。Email：danbgin811@tom.com

楊希娟，黨 斌，張 杰，張文剛，陳丹碩. 黑青稞麩皮結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)大孔樹脂分離純化工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2018，34(21)：295－303. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.037 http://www.tcsae.org

Yang Xijuan, Dang Bin, Zhang Jie, Zhang Wengang, Chen Danshuo. Process optimization on separation and purification of bound polyphenol in black highland barley bran by macroporous resin[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(21): 295－303. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.21.037 http://www.tcsae.org