一株傳染性造血器官壞死病毒的分離鑒定和系統進化分析

何亞鵬 ，劉寧 ，陳春山 ，李博 ，魏凱 ，時曉 ，郭玉丹 ，韓姝伊 ，杜迎春

（1.北京市水生野生動植物救護中心，北京 102100；2.石河子大學，新疆 石河子 832000；3.河北師范大學，河北 石家莊 050024）

傳染性造血器官壞死病（Infectious haematopoietic necrosis，IHN）是鮭鱒等冷水魚類的急性全身性傳染病，是世界動物衛生組織（OIE）規定必須申報的動物疫病，我國農業部將其列為二類動物疫病，是第I類魚類口岸檢疫疫病[1]。IHN在法國、意大利、德國、英國、日本、韓國、俄羅斯和中國等國家暴發；1985年中國東北地區首次報道IHN，目前該病在北京、河北、遼寧、吉林、山東、甘肅、青海、四川、新疆、云南等省、市、地區均有分布，并有向周圍蔓延的趨勢[2-4]。IHN的病原為彈狀病毒科、諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）。IHNV 呈子彈狀，有囊膜包被[4]。根據基因的差異，IHNV可分為5個基因型，分別為 U、M、L、E 和 JRt，其中 JRt基因型主要分布于中國、日本和韓國等亞洲地區[5-7]。IHNV主要危害鮭鱒類的魚苗及幼魚，魚苗死亡率極高，可達100%[1,3]。我國近幾年冷水魚養殖發展迅速、前景廣闊，需警惕IHNV的威脅，及時做好防控。

本研究于2018年3月從河北省某冷水魚場的發病虹鱒魚苗體內分離到1株病毒，經回歸感染、RT-PCR檢測及系統進化分析等鑒定，該病毒為IHNV。通過研究其致病性及與其他IHNV毒株的相似性和進化關系，旨在研究新分離毒株的傳播特點，并為中國傳染性造血器官壞死病的預防和疫情監測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細胞

發病死亡的虹鱒魚苗樣品采自河北省某冷水魚養殖場；鯉上皮細胞（Carp epithelial cell，EPC）由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

MEM細胞培養基、胎牛血清（FBS）購自賽默飛世爾科技有限公司；RNA提取試劑盒購于北京康潤誠業生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、2×Es Taq Master-Mix購于北京康為世紀生物科技有限公司；核酸膠回收試劑盒、克隆載體pEASY-T1 Cloning Kit、克隆感受態細胞Trans5α、質粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。試驗所用引物由華大基因公司合成，RT-PCR檢測所用外引物序列為IHN-Nf786：TCAAGGGGGGAGTCCTCGA，IHN-Nr78 6：CACCGTACTTTGCTGCTAC；內引物序列為 IHNNa323：TTCGCAGATCCCAACAACAA，IHN-Nb323：GCGCACAGTGC CTTGGCT[8]；G基因擴增引物序列為 IHN-GF：ATGGACGCCATGATCACCACT；IHNGR：TTAGGACCTGTTTGCCAGGTGATAC。

1.2 病毒的細胞培養

取患病魚肝臟、脾臟等組織加適量PBS液研磨，所得研磨液置于-80℃冰箱內反復凍融3次，8 000 r/min離心5min，取上清，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。將上述處理好的樣品稀釋100倍后接種于EPC單層細胞，在15℃的細胞培養箱中培養。每日定時觀察細胞的病變情況，當約80%的細胞出現病變后收集病變細胞液，保存于-80℃冰箱中。

1.3 回歸感染

選取100尾體質量約10g的虹鱒隨機分成兩組，每組50只。在約15℃的恒溫循環水池內飼養15d，觀察無病癥，然后進行人工感染試驗。實驗組虹鱒注射0.25mL病變細胞液，對照組虹鱒注射等量PBS溶液。每日記錄攻毒虹鱒的死亡情況，連續觀察10d，收集部分病死虹鱒樣品。

1.4 套式RT-PCR鑒定

取自然感染的病魚組織研磨液上清、病變細胞液和攻毒后死亡虹鱒的組織研磨液上清各200 μL，用RNA提取試劑盒提取RNA，進行反轉錄，以反轉錄產物為模板，根據國家標準GB/T 15805.2-2008的方法進行IHNV的套式PCR檢測。外引物為IHN-Nf786和IHN-Nr786，內引物為IHN-Na323和IHN-Nb323，以水為模板設陰性對照組。

1.5 G基因的克隆與系統進化分析

取檢測為IHNV陽性樣品的RNA進行反轉錄，以反轉錄產物為模板，利用引物IHN-GF、IHN-GR進行常規PCR，擴增該毒株的表面糖蛋白G基因序列，膠回收目的條帶，連接T載體，轉化，提取質粒，進行PCR鑒定，將鑒定為陽性的質粒送天一輝遠生物公司進行測序，將測序結果上傳至NCBI。在Genbank下載IHNV典型毒株序列，用Mega X軟件構建系統進化樹。系統進化分析參考的毒株為XJ-13 2013（JRt型）、Auke77（U 型）、Col-80（L 型）、Fn6433（M型）和Fft121-07h（E型）等。

2 結果與分析

2.1 剖檢癥狀

幼魚體表發黑，腹部膨大，肛門流出淡黃色黏液便。體表兩側、尾部和鰭條基部充血（圖1a中箭頭所示），解剖后可見腹膜嚴重出血，腸道充血（圖1b中箭頭所示），胃和腸道內有透明黏液，炎癥和出血癥狀符合急性傳染病的臨床特征，細菌學檢驗未從發病魚的肝臟和脾中分離到細菌，結合該漁場中虹鱒發病率和死亡率高的特點，初步懷疑患病魚為病毒感染。

圖1 病魚臨床特征Fig.1 Clinical signs of diseased fish

2.2 病毒的分離結果

接種組織懸液72h后EPC細胞開始收縮變圓，出現明顯細胞病變；120h后細胞呈網狀，出現空斑，脫落，而對照組細胞狀況良好。收集病變細胞液進行后續回歸感染實驗和檢測。

2.3 魚體回歸感染實驗

實驗組虹鱒注射病變細胞液感染第3 d開始出現死亡，10 d累計死亡率達72%，主要表現為急性死亡，癥狀和自然發病魚相同，對照組虹鱒無異常，全部存活（圖2）。

圖2 病變細胞液人工感染試驗結果Fig.2 Results of artificial infection test with pathological cell fluid

2.4 套式RT-PCR擴增結果

套式RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示自然感染的虹鱒魚苗、病變細胞液和攻毒后死亡虹鱒樣品第一次PCR分別出現786 bp的目的條帶（圖3a），第二次PCR分別出現323 bp的目的條帶（圖3b），與IHNV預期大小一致，陰性對照無明顯條帶。RT-PCR鑒定結果表明，自然感染的虹鱒魚苗、收集的病變細胞液、攻毒后死亡的虹鱒魚苗樣品均為IHNV陽性。

圖3 PCR檢測結果Fig.3 Result of PCR detection

2.5 IHNV分離株糖蛋白基因的系統進化分析

將鑒定為陽性的質粒成功測序后，獲得糖蛋白G基因全長，將序列上傳至Genbank，登錄號為MH374162，毒株名為IHNV-BJSY。從Genbank下載IHNV的5種基因型的G基因序列：XJ-132013（JRt型）、Auke77（U 型）、Col-80（L 型）、Fn6433（M 型）、Fft121-07h（E型）等，與IHNV-BJSY株進行核苷酸序列比對。結果表明，IHNV-BJSY株和其余參考毒株G基因核苷酸序列長度均為1 527 bp，對分離株與IHNV參考毒株G基因的核苷酸序列進行同源性比較，發現IHNV-BJSY株與中國、韓國以及日本參考毒株之間的核苷酸同源性高，和國內分離株XJ-13株、GS2014株相似性達到99%，同屬于JRt型（圖 4）。

圖4 IHNV G基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of nucleic acid sequence within G gene from IHNV

3 討論

近年來，IHN在我國多地的冷水魚養殖場持續爆發，由我國東北、東部、中部各省市向西北、西南各省蔓延，對冷水魚養殖造成嚴重威脅[1,3]。冷水魚在水溫在10℃左右時最易感染，水溫在15℃以上發病率明顯降低。IHNV感染后，鮭鱒一般會出現典型的臨床癥狀，表現為體色發黑、腹部膨大、肛門外拖有糞便，剖檢可見胃腸道內充滿白色或淡黃色乳狀液體，肝臟、脾、腎貧血蒼白，一般還伴隨腹膜、腸系膜等充血[3]。本次發病虹鱒體色發黑，腹部膨大，體表、腹膜和腸道充血等臨床癥狀與之前IHN的報道基本一致，進而進行病毒分離試驗。大馬哈魚胚胎細胞（Chinook salmon embryocells，CHSE-214）和虹鱒性腺細胞（Rainbow trout gonadal cell line，RTG-2）相比，EPC對IHNV的敏感性更高，最適合IHNV體外培養。因此，本研究利用EPC進行IHNV分離和增殖，保證最好的病毒活力，收集的病變細胞液在回歸感染中毒力強，攻毒10d累計死亡率達72%，和其他強毒株相當。本試驗根據國家標準采用套式RT-PCR方法進行IHNV檢測，結果自然感染的病魚、病變細胞液和攻毒后死亡虹鱒樣品均為IHNV陽性，證實該患病虹鱒的病原是IHNV。

根據基因差異，IHNV可分為5個基因型，分別為 U（upper）、M（middle）、L（lower）、E（Europe）和 JRt（Japanese rainbowtrout）[9,10]。最早報道的毒株基因型為U、M、L，主要分布在北美，歐洲爆發的毒株主要為E基因型。在亞洲地區，日本最先報道該病，剛開始流行的毒株主要為U基因型，近年來在日本發現1個新的基因型JRt[11,12]。G基因系統發育分析表明，IHNV-BJSY株和其他眾多中國分離株均為JRt基因型；同源性分析表明，我國分離株與韓國株及日本株具有相對最高的核酸同源性。結合我國流行毒株的基因型和上世紀末中國從日本引進虹鱒受精卵的史料分析，中國IHN的爆發極有可能和從日本引入虹鱒受精卵有關。

IHNV是嚴重危害鮭鱒魚類的病毒，對魚苗致死率極高，一旦爆發，難以控制。如果IHN在我國冷水魚養殖地區長期流行，勢必蔓延發展，產生嚴重危害，制約我國鮭鱒養殖業的發展。許多國家和地區均因魚卵檢疫不嚴而傳入該病，我國應進一步完善鮭鱒良種場的職能，對苗種場等進行持續監測，促進其生產出優質無污染的發眼卵，對引進的魚卵和種魚進行嚴格的檢疫，從源頭上控制IHN的擴散，凈化我國鮭鱒養殖場，保障鮭鱒養殖業的繁榮發展。