鯉春病毒血癥病毒的研究進展

林婧楠，趙景壯，盧彤巖，徐黎明

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

鯉春病毒血癥病毒屬單股負鏈RNA病毒目，彈狀病毒科Rhabdoriridae，暫定為水泡性病毒屬Vesiculorius，被類脂囊膜包裹的彈狀病毒[1]。鯉春病毒血癥的潛伏期較短，沒有典型的外部臨床癥狀，容易誤診。目前尚無有效控制該病的方法，一旦出現疑似該病的癥狀，應及早確診，隔離感染和帶毒的病魚，截斷水平傳播途徑及捕殺來控制。

1 病原生物學特征

CSVV病毒粒子在15%～60%的蔗糖溶液中浮力密度為1.16g/mL[2,3]，在5%～25%的蔗糖梯度中沉降系數為38～40S[4]。外界環境的改變影響病毒的感染性，對酸（在pH3時30min，侵染率1%）、堿（在pH11時，侵染率50%～70%，pH7～10時最為穩定）、熱（56℃，30min）、脂溶劑以及乙醚最為敏感，其他化學試劑，如2%NaOH、500mg/L含氯消毒劑、0.01%碘，在特定濃度和作用時間可使病毒失活，可用于養殖消毒。血清可以保護病毒的侵染力，實驗室常用2%血清培養液保護病毒。含有血清時，經過4次反復凍融，侵染率在90%左右，而缺乏血清時，侵染率僅為5%左右。冷凍真空干燥可長期保存病毒[5]。

2 基因結構特征

CSVV粒子為典型的彈狀結構，一端圓弧形，另一端平坦，長90～180nm，寬60～90nm[5-7]。其基因組全長為 11 019bp[8]，由非翻譯前導（Leader）區、基因區、基因間連接區及非轉錄拖尾（Trailer）區4個主要部分構成（圖1）。

基因前導區有69bp，前19bp可能為啟動子，其中50～56bp（GAAAAAT）為前導RNA轉錄終止信號，60～64bp（AACAG）為N基因轉錄起始信號。

基因區共包含5個開放閱讀框（ORFs），編碼5種結構蛋白：核蛋白（Nuclear protein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質蛋白（Matrixprotein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）和 RNA 聚合酶（RNA polymerase，L），3’端到 5’端的排列順序為 N-P-M-G-L。

核蛋白（N）在病毒粒子中含量最多，主要與RNA緊密結合構成直徑約50nm、呈螺旋對稱的核衣殼。該結構蛋白在轉錄調節中起重要的作用[6]。

磷蛋白（P）為核衣殼的組成部分，呈酸性，純化后SVCV的P蛋白在SDS-PAGE中分子量約50kD，高于推算的結果（35.5kD），其原因可能是P蛋白N端（45～88）存在一個大的負電荷結構域[8]。

基質蛋白（M）由223個氨基酸組成，呈磷酸化、高度堿性，構成囊膜內表面。糖蛋白通過M蛋白與螺旋狀核衣殼相連，共同實現病毒粒子的裝配、出芽的啟動功能。

糖蛋白（G）由509個氨基酸構成，病毒粒子的囊膜表面有長釘狀的糖蛋白突起。成熟的糖蛋白為三聚體囊膜粒子，由3部分構成：胞外結構域、跨膜結構域和胞漿結構域，是典型的跨膜蛋白，能選擇性地識別宿主細胞受體，促使二者的膜融合，介導病毒內吞，使宿主細胞感染致病；在免疫系統下，識別病原，誘導宿主產生中和抗體。糖蛋白含有與免疫相關的抗原決定簇，對血清學特征起決定性作用，是當前DNA疫苗設計研究的熱點。2002年至2004年，劉葒等[9]從養殖的鯉科魚類和觀賞魚中分離出8株CSVV，測定了其G蛋白編碼的基因序列，發現我國的這8個分離株與USA株、980451株、980528株和970469株在系統發育樹上的進化方向一致。根據Stone等[10]對各地分離出的部分CSVV的G蛋白基因序列以及Basic等[11]1994年至2007年收集的22株G蛋白部分核酸序列的分析和系統發育樹比較，將CSVV的基因型分成Ia、Ib、Ic和Id 4個亞組，Ia和Id的變異度較高，又將有明顯差別的3個Id基因組毒株劃分為Id1、Id2及Id3。CSVV中的一個血清型能與狗魚苗彈狀病毒（Pike fry rhabdovirus,PFRV）產生交叉反應。前期研究發現，中國CSVV的分離株的基因型為Ia[12]。

RNA聚合酶（L）是核衣殼的組成成分，可與N、P蛋白共同組成病毒內核衣殼的RNA蛋白復合物，完成病毒的轉錄和復制。

圖1 鯉春病毒血癥病毒（carp spring virernia virus,CSVV）病毒結構、基因組結構以及連接順序（引自http://viralzone.expasy.org/4657）Fig.1 Structure,genomic and linkage of carp spring virernia virus（CSVV）

在基因間連接區的G-L基因中存在4bp（CTAT）保守序列，其余基因間存在2bp（CT）保守序列[13]。該調控區存在于水泡病毒屬中；G-L基因間不存在類似粒彈狀病毒屬編碼的非結構蛋白（nonstructural protein，NVprotein）基因。該蛋白在病毒復制過程中起重要作用，這兩點均為區分粒彈狀病毒屬和水泡性病毒屬的重要標志。

拖尾區有49bp，其中TATG（A）7為L基因轉錄終止信號，末端的8個核苷酸序列（GTCTTCGT）與前導區末端（ACGAAGAC）呈反向互補，是彈狀病毒基因組及不分段負鏈RNA病毒的共同特征[8]。

與同屬的其他彈狀病毒相比，CSVV的蛋白序列中L蛋白間的同一性最高，與VSV的L蛋白氨基酸序列同一性達53.6%[14]；與水皰性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的M蛋白同一性達28%，在羧基末端的同一性較低[15]。

3 分類特征

迄今已報道的魚類彈狀病毒（Fish rhabdovirus）有十幾種，鯉春病毒血癥病毒（CSVV）是其中的一種，此外還包括病毒性出血敗血癥病毒（Viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒 （Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、日本牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）、狗魚苗彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）、彈狀病毒 903/87（Rhabdovirus 903/87,903/87）、鱖彈狀病毒（Mandarin fish Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、胭脂魚彈狀病毒（Chinese sucker rhabdovirus，CSRV）及新近分離出的海鮭彈狀病毒28/97（Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV28/97）等[16-19]。

彈狀病毒科包括水泡性病毒屬（Vesiculovirus）、狂犬病毒屬（Lyssavirus）、暫時熱病毒屬（Ephemerovirus）和粒彈狀病毒屬（諾拉彈狀病毒屬，Novirhabdovirus）。其中粒彈狀病毒屬是國際病毒分類委員會第7次報告上設立的一個新屬。根據是否含有編碼非結構蛋白的基因，將傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、鱧彈狀病毒、牙鲆彈狀病毒歸為粒彈狀病毒屬。而鯉春病毒血癥病毒和狗魚苗彈狀病毒暫定為水泡性病毒。

4 流行情況

鯉春病毒血癥病毒感染的魚類較為廣泛，主要感染鯉科魚類，如錦鯉Cyprinus carpio、草魚Cten opharyngodm idellus、鯽 Carassius auratus、鰱 Hypophthalmichthys molitrix、鳙 Aristichthys nobilis、金魚 Carassius auratus、擬鯉 Rutilus rutilus、圓腹雅羅魚Leuciscus idus和丁鯛Tinca tinca等。此外，自然感染的魚類還有六須鲇Silurus glanis[20]。一齡以上的鯉最易感染患病。在中世紀，該病在歐洲開始流行，對歐洲各國鯉科魚類養殖業造成了巨大的經濟損失[21]，而后向美洲和亞洲等地傳播。我國于2003年首次在天津養殖場的觀賞魚中分離出SVCV[22]。目前，該病已成為全球性魚類的疾病。

該病毒可在13～22℃下生長，最適為17℃。因此，SVC常在水溫15～20℃的春季爆發，17℃左右發病率高，水溫超過20℃有所下降，超過22℃不再發病。

染毒魚、病魚和病死魚是主要的傳染源，以水平傳播為主，垂直傳播次之。水平傳播包括直接接觸傳播和間接傳播，間接傳播包括非生物媒介（水）；生物媒介（水生吸血寄生蟲）以及污物傳播。病毒隨附著污物（糞便、尿液、皮膚黏液和性腺分泌液等）排出體外，4～10℃時水中和泥中仍具有感染性，可保持4～6周[5,23]，可通過鰓進入魚體內，在血液中保持11周左右。

5 臨床癥狀及病理變化

5.1 臨床癥狀

行為變化：早期病魚呼吸困難，需氧量高，常聚集在池塘進水口附近，食欲減退，行動遲緩，對應激的反應遲鈍，身體平衡力降低；后期病魚萎靡，身體傾斜，常臥于池底[21,24]，嚴重時停止游動。

臨床癥狀：病魚體表發黑、眼球突起、鰓絲蒼白、皮膚表面和肌肉有出血點、腹部腫脹、內有積水，肛門處拖有一細長、黏稠、糞便樣的腸黏膜炎癥產物與排泄物的混合產物，常稱之為“假糞”，但不屬于該病的特征性癥狀。

5.2 病理變化

染毒魚最終因體內水鹽平衡失調致死。剖檢病魚發現，主要以全身性出血、水腫為主要特征癥狀。病毒通常在毛細血管內皮細胞、造血組織和腎元細胞等部位增殖。在感染期，肝、腎、脾、鰓、腦髓病毒含量較高，常作為檢驗組織，發病3周后，含量迅速下降消失。血液中病毒滴度不高，但持續時間長。肝臟實質組織出現多個病灶壞死、充血，可見黃疸現象；胰臟組織出現炎癥以及大量壞死病灶；脾臟充血，網狀內皮大量增生；腸道嚴重發炎，出現卡他性腸炎。

6 檢測技術

CSVV病毒可在鯉上皮瘤細胞（EPC）、草魚性腺細胞（CO）、鳙尾柄細胞株（FHM）、藍鰓太陽魚成纖維細胞（Lepomis macrochirus，BF-2）和虹鱒性腺細胞（RTG-2）等魚類細胞株上增殖，造成細胞病變效應（Cytopathogenic effect，CPE）。病變細胞內出現顆粒，H＆E染色可見胞質萎縮空泡化，核膜增厚，顯微鏡下可見脫落的細胞變亮[20]。FHM和EPC細胞最敏感，為OIE推薦的分離病毒的細胞。EPC和FHM的最適溫度為20～25℃和20～22℃，產生的最大感染性為109TCID50/mL。該病毒除了在魚類細胞中增殖，還能在禽類、哺乳類和兩棲類動物細胞內增殖。

6.1 傳統的檢測方法及免疫學方法

目前，國內外常采用細胞培養法分離、檢測CSVV病毒，再通過中和試驗確定。該方法雖然準確率高，但檢測大約需要2周左右，耗時費力。

在細胞培養分離病毒的基礎上，可采用免疫學的方法，如酶聯免疫吸附檢驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進行鑒定、間接熒光抗體試 驗 （Indirect fluorescent antibody test，IFAT），但CSVV的囊膜來自宿主的細胞膜，易產生非特異性的抗體，因而病毒的抗血清效價不高，影響檢測結果[25]。CSVV在血清學上區別于其他彈狀病毒，采用ELISA可能會與其他魚類彈狀病毒如VHSV、IHNV等發生交叉反應，還與PFRV有共同的抗原決定簇，在ELISA和間接熒光（IF）中有明顯的交叉反應[26,27]。高隆英等[26]根據CSVV糖蛋白基因序列設計逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和半嵌套PCR（semi-nested-PCR）的引物 F1、R2、R4，其中 F1和R2可擴增出CSVV核酸中的714bp片段，F1和R4可擴增出606bp片段。特異性檢測結果表明，與VHSV、IHNV和PFRV無交叉反應，具有良好的特異性，可在42h內得到結果。

6.2 OIE檢測標準

根據OIE公布的《水產動物檢測手冊》，目前我國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T1152-2002以及我國規定的GB/T 15805.5-2008魚類檢疫方法，常規檢測CSVV方法是通過細胞培養分離病毒后，采用RT-PCR方法進行診斷。該過程需經過兩代的細胞培養，時間長，檢測效率低。王姝等[28]在國家行業標準的基礎上，有機結合細胞培養法，利用酶聯免疫吸附試驗ELISA進行初步的篩選，再用RT-PCR復查，即實現高通量檢測，整個用時又比國家標準用時縮短了一半。

6.3 核酸探針檢測方法

Svetlana F等[29]根據CSVV-S30株的M和G基因的核酸序列設計引物，構建生物素標記的核酸探針，應用RT-PCR和斑點雜交技術成功在感染CSVV的細胞培養液和魚組織中檢測出病原體，其中在腦組織中最易檢測出該病毒。利用生物素標記的核酸探針方法，既實現了快速檢測，又提高了其靈敏度。

6.4 熒光RT-PCR檢測方法

張利峰等[30]根據鯉春病毒血癥病毒的核酸保守區序列，建立了快速檢測CSVV的熒光RT-PCR檢測技術，僅需4h就可以檢測出10-6病毒稀釋液，不僅試驗周期短、靈敏，還實現了對病毒模版RNA的定量。安偉等[31]根據CSVV的核蛋白的保守序列，成功建立了SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測技術，病毒檢測下限100.76TCID50/mL，靈敏度高于常規PCR 100倍。

6.5 數字RT-PCR檢測方法

吳斌等[32]利用“油包水”的形式，對RT-PCR的擴增反應進行計數，建立了數字RT-PCR的技術。與實時定量RT-PCR相比，在兩者均能檢測病毒的104稀釋倍數基礎上，擁有更高的靈敏度。

6.6 間接ELISA檢測方法

郭闖等[33]以超速離心法純化CSVV，免疫大白兔，制備了兔抗CSVV免疫血清，同時利用間接ELISA方法快速檢測CSVV，以兔抗SVCV血清1∶300稀釋后包被96孔酶標板，滴度篩查CSVV陽性毒株，結果與RT-PCR鑒定結果相同。整個過程需要1 d，具有周期短、準確的優點。

6.7 新型液相芯片檢測技術

尹偉力等[34]根據GenBank中CSVV的G基因序列，找出25對保守堿基作為檢測探針，設計引物并進行生物素標記，通過液相芯片儀器檢測偶聯熒光編碼微球與CSVV的RT-PCR產物雜交反應產生的熒光信號，發現液相芯片檢測體系在鑒別CSVV上具有高特異性和靈敏度，最低檢出量為10 pg。

6.8 環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）

Shivappa等[35]對美國卡羅萊納州分離的CSVV菌株的G蛋白基因序列，設計出4套引物，分別進行LAMP和RT-LAMP擴增，證實建立的RT-LAMP對CSVV的檢測具有特異性，與RT-PCR的靈敏度相似，最低檢測量達101TCID50/mL。

陳進會等[36]依照G基因保守序列，設計3套LAMP引物，通過恒溫實時熒光檢測系統ESE-Quant tube scanner，第1套和第3套有峰值，進而引入環引物。結果顯示，第1套LAMP引物的檢測穩定性、靈敏度和特異性效果最佳，能夠實現高效檢測CSVV。因此，實時熒光LAMP法具有極佳的靈敏度和快速檢驗的優勢，適用于基層檢驗，檢測限度可達到每反應2.4 pg。

7 防治方法

目前對于該病沒有特效藥和有效的控制方法，只能通過化學、物理消毒的方式預防該病。一旦發現該病，應及時中斷傳染源，隔離或撲殺病魚和帶毒魚，防止大規模疫病的爆發[31]。在20世紀80年代，歐洲出現了含CSVV和PFRV的二階滅活疫苗，能夠誘導鯉科魚類產生高效的中和抗體。隨后，成功開發了CSVV弱毒疫苗，在養殖漁業中有良好的應用前景。給體質量40～100g的鯉腹腔注射6.3×104TCID50后，免疫保護率在90%以上[37]。我國的CSVV疫苗研制還處于探索階段，主要的研究領域集中在減毒疫苗、亞單位疫苗及核酸疫苗等。

傳統滅活疫苗、減毒疫苗具有毒力返強的缺點[25]，需要添加佐劑，存在一定的安全隱患，應用效果不穩定。

DNA疫苗是90年代的最新一代疫苗，無需像傳統的滅活疫苗添加佐劑，卻仍具備傳統疫苗的優點。DNA疫苗構型更接近天然構象，潛在致病性低，適于工廠化集中生產，相對安全，具有一定的應用價值[38]。CSVV疫苗的研發有一定的進展，Kanellos等[39]以CSVV G蛋白基因，設計了構建穩定性較好的DNA疫苗。為評估已構建的4組CSVV糖蛋白DNA疫苗的免疫效果，歐陽征亮等[40]通過肌肉注射的免疫途徑誘導機體產生免疫。結果顯示：第一組重組質粒DNA編碼全長的G蛋白疫苗保護率為14.47%；第二組重組質粒DNA編碼去C端信號肽的G蛋白疫苗保護率為22.22%；第三組重組質粒DNA編碼去N端跨膜區的G蛋白疫苗保護率為17.32%；重組質粒DNA編碼同時去C端信號肽和N端跨膜區的G蛋白疫苗保護率為17.32%。Emmenegger等[41]的鯉攻毒試驗驗證，已構建的CSVV的G蛋白DNA疫苗的保護效率為50%～88%，能夠有效降低感染鯉的死亡率。

8 展望

鯉春病毒血癥是一種高致病性、高死亡率的鯉科魚類傳染性疾病。目前，對該病毒的疫苗研制尚處于探索階段。盡管SVC的DNA疫苗已取得一定的進步，但是在DNA疫苗的效率優化、安全性以及疫苗的免疫途徑上仍然存在一些問題。同時，DNA疫苗的作用及代謝機制還有待進一步探索[37]。