桂科豬主要免疫指標測定與初步分析

蘇乾蓮 梁家幸 李斌 周英寧 陳忠偉 謝炳坤 閉炳芬 秦毅斌 盧冰霞 何穎 段群棚 盧敬專 蔣冬福 潘天彪 趙武*

(1，廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001；2，廣西畜牧研究所530001)

桂科豬是由廣西畜牧研究所利用廣西優良本地品種陸川豬作為母本與杜洛克作為父本培育出來的一個新的配套系豬種，兼具本地豬肉質鮮美和外來豬生長速度快雙重優點[1]。機體抗病力一般受先天免疫和后天免疫所協調。先天性免疫快速，無特異性，是防御的第一線，主要與嗜中性細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、補體、干擾素和急性蛋白因子有關。后天性免疫涉及到淋巴細胞 (如T細胞、B細胞)，通過獨特的遺傳機理產生特殊的抗原反應。二者通過直接與細胞接觸或通過包括化學介質、細胞因子和趨化因子相互作用[2]。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，是機體內特異高效調控免疫細胞和協調免疫應答最重要的信號分子，可髙效調節免疫反應、炎性反應、組織修復、移植排斥反應和造血功能等，并且在各類具有免疫活性細胞的分化、發育、成熟和活化中起著十分重要的控制作用[3]。

Th細胞主要分為Th1和Th2兩個亞類，通過產生不同類型的細胞因子，達到Th1/Th2平衡[4]。Th1細胞遷移入感染位點并分泌細胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-β，促進細胞介導的免疫應答并可抵御病毒等胞內病原體。Th2細胞促進體液免疫應答，其刺激B細胞增殖、抗體分泌及抗體類別轉換為IgE和IgA，它們分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13[5]。白細胞介素-2（IL-2）又稱T淋巴細胞生長因子（TCGF)，在分裂素或特異性抗原刺激作用下，主要由活化的輔助性T淋巴細胞（CD4+和CD8+)分泌產生，還可由T細胞瘤細胞和一些前T細胞、前B細胞產生，甚至自然殺傷性細胞（NK)和淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK)也可產生[6]。白細胞介素-4（IL-4）是由抗原或有絲分裂原誘導Th2細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞等產生的特征性細胞因子[7]。白細胞介素-10（IL-10）是Th2細胞產生的一種細胞因子，主要是抑制Th1細胞的分泌，也可刺激效應B細胞的增殖分化，并且能產生抗體，具有雙向調節作用[8]。 γ-干擾素（IFN-γ)是由病毒或其他干擾素（IFN)誘生劑刺激使人或動物活化的T細胞和NK細胞產生的一類高活性、多功能的生物活性糖蛋白，屬于Th1型細胞因子，具有較強的免疫調節活性，對細胞免疫和體液免疫具有放大作用[9]。IL-2等免疫指標可作為抗病育種的間接指標，通過評估免疫指標是選育提高動物抗病性的一條有效、可行的途徑[10]。本試驗以桂科豬作為試驗對象，對其主要免疫指標進行測定與初步分析，試驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑盒及疫苗

Procine IL-2 ELISA KIT 96T、Procine IL-4 ELISA KIT 96T、Procine IL-10 ELISA KIT 96T、Procine IFN-γ ELISA KIT 96T均購自上海研晶生物科技有限公司，Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit購自美國IDEXX公司。豬瘟活疫苗（傳代細胞源）購自中牧實業有限公司。

1.2 試驗動物

本次試驗采用廣西畜牧研究所桂科豬育種場提供的2014年10月1日出生的19頭健康桂科育成豬和2014年10月9日出生的22頭健康桂科育成豬，體重在35～60kg，對豬群進行連續7次采血，7周齡開始，每周1次直至13周齡。

1.3 血樣采集

采血前禁食12h，記錄豬只性別、編號、免疫情況。前腔靜脈采集血液3ml放入無抗凝劑的離心管中，并標記相應的編號，直接送回本實驗室制備血清。

1.4 細胞因子測定

血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量采用ELISA法進行測定，按試劑盒說明書進行操作。

1.5 抗體檢測

根據豬瘟疫苗二免時間每批豬選擇5個時間點的血清，用IDEXX豬瘟病毒抗體檢測試劑盒對桂科豬血清中的特異性豬瘟病毒抗體進行檢測。

1.6 統計分析作圖

原始數據用Excel進行初步分析，采用SPSS19.0版進行單因素方差分析，用Duncan's法進行顯著性檢驗，用Pearson方法進行相關性分析。用Graphpad軟件對阻斷值做圖并分析豬瘟抗體消長規律。

2 結果

2.1 細胞因子測定結果

由表1顯示，IL-2在第10周與第1周差異顯著（p＜0.05），第11、12、13周分別與第7、8、9、10周差異極顯著（P＜0.01）；IL-4在第8、11周分別與第9周差異顯著（p＜0.05），第12、13周分別與第8、11周差異顯著（p＜0.05），第7、12、13周分別與第9、10周差異極顯著（p＜0.01），第8、11周分別與第10周差異極顯著（p＜0.01）；IL-10在第12周分別與第11、13周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、8、9、10周差異極顯著（p＜0.01），第11、13周分別與第8周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、9、10周差異極顯著（p＜0.01）；IFN-γ在第12周與第11周差異顯著（p＜0.05），分別與第7、8、9、10周差異極顯著（p＜0.01），第13周分別與第9、10周差異顯著（p＜0.05）。

圖1 IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值變化曲線

表1 細胞因子測定結果（單位：ng/L）

表2 不同免疫指標不同時間段相關性分析結果

2.2 免疫指標測定結果分析

由表2可知，7～10周，血清中IFN-γ與IL-2呈極顯著負相關（p＜0.01），與IL-4呈極顯著正相關（p＜0.01）；IL-4與IL-2呈極顯著負相關（p＜0.01）。10～12周，IL-4與IL-2呈顯著正相關（p＜0.05）；IL-10與IL-2呈顯著正相關（p＜0.05），與IL-4呈極顯著正相關（p＜0.01）。12～13周，IFN-γ 與IL-2呈極顯著正相關（p＜0.01），與IL-4呈極顯著負相關（p＜0.01），與IL-10呈極顯著正相關（p＜0.01）；IL-4與IL-2呈極顯著負相關（p＜0.01）；IL-10與IL-2呈極顯著正相關（p＜0.01），與IL-4呈極顯著負相關（p＜0.01）。由圖1可知，IL2+IFN-γ與IL-4+IL-10的比值在約第10周齡達最小值，在約第13周齡恢復到原來比值。

2.3 豬瘟抗體檢測結果分析

兩批豬豬瘟疫苗首免時間皆為22日齡，加強免疫時，第一批豬在70日齡進行，第二批豬在62日齡進行，兩批豬加強免疫后豬瘟抗體水平皆比首免后第一次采樣血清中的抗體水平有一定程度的提高。樣本阻斷率與抗體水平呈正相關，豬瘟抗體消長趨勢如圖2和圖3。

3 討論

圖2 第一批桂科豬豬瘟抗體消長趨勢

圖3 第二批桂科豬豬瘟抗體消長趨勢

IL-2能維持和促進T細胞和B細胞增殖與分化，增強單核細胞和NK細胞的殺傷活性，誘導淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK)和γ-干擾素的產生及多種細胞因子受體表達，還可以增加抗原遞呈細胞表面MHCI類分子和MHCII類分子的數量，增強抗原遞呈作用，促進免疫球蛋白（IgM和IgG)的分泌[6]。IL-4具有重要的免疫功能，可增強B細胞和T細胞的相互作用，促進體液免疫應答，尤其是IgE的分泌，還可誘導單核-巨噬細胞表達MHCII類分子，增強其抗原遞呈能力，改善造血細胞的增殖與分化，誘導CD4+Th幼稚前體細胞定向分化為Th2型細胞，抑制Thl細胞產生細胞因子，是Th2細胞分泌的自我調節生長因子，對腫瘤細胞具有細胞毒作用[7]。IL-4可以抑制NK細胞黏附于內皮細胞，并抑制其進一步聚集和活化、抑制蛻膜NK細胞表達IL-2受體，從而阻斷NK細胞活性及其對滋養層的損傷[11]。IL-10能抑制Th1細胞源性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 和 Th2細胞源性細胞因子IL-4、IL-5的產生，還能通過抑制T淋巴細胞產生IFN-γ、IL-2直接影響T細胞的分化和增殖，但IL-10能提高抗凋亡蛋白BCL-2的表達，促進B細胞表面高親和力IL-2受體過表達[12]。IFN-γ具有廣譜抗病毒活性，可誘導機體產生多種抗病毒蛋白，對多種病毒均有抑制作用，能夠增強NK細胞、K細胞的殺傷活性，增強組織相容抗原和某些受體的表達，還能增強巨噬細胞的殺傷和吞噬能力，促進巨噬細胞的細胞毒活性，抑制病毒在新感染細胞內的復制，還可通過刺激抗原遞呈細胞表達MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子增強機體的獲得性免疫反應，利于向殺傷性T細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，通過特異性CTL加速病毒的清除[9]。

本試驗結果顯示IL-2在第10周分別與11、12、13周差異極顯著（P＜0.01），與第1周差異顯著（p＜0.05）；IL-4在第10周分別與7、8、11、12、13周差異極顯著（p＜0.01）；IL-10在第10周分別與11、12、13周差異極顯著（p＜0.01）；IFN-γ在第10周與第11周差異極顯著（p＜0.01），與第13周差異顯著（p＜0.05）。注射豬瘟疫苗后對Th1/Th2有直接的影響，IL2+IFN-γ/IL-4+IL-10比值在約第10周齡達最小值，注射疫苗兩周后達最高并很快恢復到原來比值。7～13周，血清中IL-2經歷了先減少后增加的變化，IL-4經歷了先增加后減少的變化，IL-10、IFN-γ經歷了不同程度的先增加后減少再增加的變化，彼此間的相關性也處在動態變化中。IFN-γ與IL-2的相關性從極顯著負相關（p＜0.01）到無顯著相關再到極顯著正相關（p＜0.01）；IFN-γ與IL-4的相關性從極顯著正相關（p＜0.01）到無顯著相關再到極顯著負相關（p＜0.01）；IFN-γ與IL-10的相關性從無顯著相關到極顯著正相關（p＜0.01）。IL-4與IL-2由極顯著負相關（p＜0.01）到顯著正相關（p＜0.05）再到極顯著負相關（p＜0.01）。注射豬瘟疫苗會影響細胞因子分泌和特異性抗體的產生，調節Th1/Th2平衡。

4 結論

綜上結果表明，桂科豬這一新的配套系豬種有良好的免疫系統和免疫功能，本試驗數據可以為開發有特色的商品豬生產模式疫病防控提供科學依據。