環介導恒溫擴增檢測生鮮果蔬中致病菌

王文博，苑學霞，鄔元娟，馮靜，劉磊，李瑞菊，李鴛鴦，張露月

(1. 山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/山東省食品質量與安全檢測技術重點實驗室，山東 濟南 250100；2. 山東省農業科學院-北卡羅萊納州立大學農產品檢測技術和風險評估聯合實驗室，山東 濟南 250100；3. 北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；4. 北京良潤生物科技有限公司，北京 102200；5. 煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264000)

作為全球性問題，食源性疾病廣泛威脅公眾安全，由果蔬攜帶致病微生物引發疾病的現象也呈逐年增加趨勢[1]。近幾十年來，許多發達國家對新鮮農產品的需求日益增加[2]，然而，生食蔬菜特別是綠葉蔬菜可以傳播致病菌和病毒[3-5]，且被致病菌污染的果蔬很難通過常規方法清洗干凈[6]，因此引起了各國對即食果蔬是否含有致病菌的高度重視。

目前，傳統的檢測方法費時費力且靈敏度低，不能滿足快速檢測需求[7. 8]，同時增加了企業的儲藏成本、質量控制成本及政府對食品安全的監管難度。環介導等溫擴增技術(LAMP)是日本學者Notomi等[9]于2000年開發的一種新型恒溫核酸擴增方法，該技術特點是針對靶基因的6個區域設計2對特異引物，引物在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫擴增。LAMP快速檢測致病菌在臨床、醫藥等行業已被廣泛應用，但應用于農產品尤其即食蔬菜水果的相關研究報道較少。

本試驗選取8種污染風險較高的即食生鮮果蔬為研究材料，利用 LAMP技術檢測其中沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌和單增李斯特菌，并與國家標準方法進行比較，旨在為即食生鮮果蔬中致病菌的監測提供一種快速、準確的檢測手段，為生鮮果蔬行業的健康發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 蘋果、草莓、番茄、香菜、苦菊、葡萄、結球生菜和黃瓜(購自濟南七里堡蔬菜批發市場)。

1.1.2 試驗菌株 沙門氏菌(ATCC14028)、阪崎腸桿菌(P5)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希氏菌O157(NCTC12900)、志賀氏菌(10130)和單核細胞增生李斯特氏菌(CMCC4002)，由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.1.3 試劑 生理鹽水、致病菌(沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌和單增李斯特菌)相應的二次增菌液、腦浸液、無菌拭子、API試劑條、7.5%氯化鈉肉湯培養基、緩沖蛋白胨水培養基、金黃色葡萄球菌顯色培養基、血平板、營養瓊脂、沙門氏菌顯色培養基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養基、葡萄球菌乳膠凝集試驗試劑盒，購自廣東環凱微生物科技有限公司。聯合增菌液，由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.1.4 試劑盒 沙門氏菌核酸LAMP檢測試劑盒、阪崎腸桿菌核酸LAMP檢測試劑盒、金黃色葡萄球菌核酸LAMP檢測試劑盒、大腸埃希氏菌O157核酸LAMP檢測試劑盒、志賀氏菌核酸LAMP檢測試劑盒、單核細胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒，均由北京勤邦生物技術有限公司提供。

1.1.5 儀器與設備 拍擊式均質器，購自西班牙IUL公司；生化培養箱，購自上海新苗醫療器械制造有限公司；高壓滅菌鍋，購自山東省新華醫療器械股份有限公司；其它儀器有高速冷凍離心機；Mini離心機、金屬浴、超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 準確度及靈敏度試驗 將8種蔬菜水果樣品去掉表面泥土，各稱量四份，每份稱量25 g，其中一份作為陰性對照，三份分別對應加培養好的沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌 O157、志賀氏菌和單增李斯特菌菌液的低(L)、中(M)、高(H)濃度(見表2)，然后加入225 mL聯合增菌液，36℃培養18～24 h。同時采用國家標準方法進行檢測[10-15]。

取過夜培養的菌液1 mL加到1.5 mL無菌離心管中，14 000 r/min離心2 min，吸棄上清液，加入80 μL DNA提取液，混勻后95℃孵育10 min；14 000 r/min離心2 min，上清液即為核酸模板；將上清液移至另一潔凈1.5 mL無菌離心管于-20℃保存。

加入22.5 μL復溶液于反應管中，然后加30 μL石蠟油，最后按順序分別加入陰性對照、待測模板、陽性對照各2.5 μL；利用Mini離心機瞬時離心，剪取相應數量顯色管蓋，蓋緊，并置于金屬浴中65℃恒溫反應60 min。

反應結束，反應管顛倒約停留5 s，使反應液與顯色液(顯色液在蓋中)充分混合，觀察結果。在陰性對照反應管呈橙色、陽性對照反應管呈綠色前提下，若待檢樣本反應管呈綠色，則可報告為檢測對象陽性；若待檢樣本反應管呈橙色，則可報告為檢測對象陰性。

1.2.2 重復性試驗 取同一污染的蔬菜，分別用3個批次試劑盒重復檢測3次， 記錄檢測結果。

1.2.3 特異性試驗 取蔬菜樣品 6 份，分別加入培養的沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌、單增李斯特菌懸液，混勻后取樣增菌，每個樣品用6種核酸 LAMP檢測試劑盒進行檢測。

2 結果與分析

2.1 準確度試驗

對于生鮮果蔬中6種致病菌，核酸 LAMP方法和國家標準方法檢測結果一致，陽性結果和陰性結果符合率為100%(表1)。

表1 核酸 LAMP 方法和國家標準檢測方法比較

注： P：蘋果；C：草莓；F：番茄；X：香菜；K：苦菊；G：葡萄；S：生菜；H：黃瓜；H、M、L分別為高、中、低三個濃度；CK為只添加聯合培養液。未添加菌液的陰性對照；供試菌株L和G分別代表LAMP方法和國標方法。

2.2 靈敏度試驗

添加致病菌不同菌落數，LAMP方法檢測結果均為陽性(表2)，因此 LAMP 方法檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌 O157、志賀氏菌、單增李斯特菌的靈敏度均為 5 CFU/g。

表2 LAMP 方法靈敏度試驗結果

2.3 重復性試驗

對生鮮果蔬中6種致病菌進行檢測，核酸 LAMP 檢測試劑盒 3 個批次的檢測結果均為陽性，結果一致(表3)。

表3 不同批次LAMP檢測試劑盒重復性試驗結果

2.4 特異性試驗

金黃色葡萄球菌 LAMP 方法只檢測金黃色葡萄球菌為陽性，與其他供試致病菌無交叉反應，特異性強(表4)。其他5種菌的LAMP方法也是如此。

表4 LAMP 方法特異性試驗結果

3 討論與結論

據美國疾病預防控制中心(CDC)2013年報告顯示，美國1998—2008年爆發的273120 次食源性疾病事件中71%與食源性致病微生物相關[1]。而導致染病并發病的相關食品中葉類蔬菜和水果/堅果分別達到13%和11%，其中諾瓦克病毒常見于葉類蔬菜，水果和根莖類蔬菜上的沙門氏菌以及牛肉和葉菜類蔬菜上的大腸桿菌導致最高的染病住院率；水果上的沙門氏菌及葉菜類蔬菜上的大腸桿菌均具有最高的致死率[16, 17]。對食源性致病微生物及時檢測與鑒定，是降低危害的有力措施之一。傳統的致病微生物檢測鑒定方法耗時、繁瑣，已不能滿足快速檢測的需求。

LAMP 檢測方法只需恒溫就能完成擴增反應，快速、高效、耗時短。張裕君等[18]建立了苜蓿疫霉根腐病菌LAMP檢測方法，其可在恒溫條件下40 min完成擴增，檢出0.1 ng苜蓿疫霉根腐病菌基因組DNA的存在。此外，LAMP檢測方法靈敏度較高，檢測牛肉中大腸桿菌O157的靈敏度為9.8 CFU/mL，人工污染牛肉的檢出限為68 CFU/g；而PCR檢測牛肉中大腸桿菌O157的靈敏度為980 CFU/mL，人工污染牛肉的檢出限為6.8×103CFU/g[19]。本試驗中，LAMP 方法檢測沙門氏菌、阪崎腸桿菌等致病菌的靈敏度為5 CFU/g，且與國標檢測結果一致，準確度較高。

此外，LAMP檢測方法因其簡便、快速、高特異且不需要特殊試劑和儀器設備等優勢，在多個行業均得到廣泛應用。其中，LAMP檢測方法在檢測水果蔬菜方面也已得到應用[1]，但多用于果蔬中病毒的檢測[20-22]，如朱林慧[23]建立了用于檢測進境水果與種苗中冬生疫霉、下香疫霉和栗黑水疫霉的LAMP方法，其靈敏度遠高出常規PCR與多重實時熒光PCR。關于食源性致病菌的檢測報道較少，張體銀等[24]應用LAMP方法對10個蔬菜樣品中單增李斯特菌進行了檢測。本試驗對于生鮮蔬菜中6種致病菌的檢測結果證明，LAMP檢測方法重復性好且特異性高。

綜上所述，生鮮果蔬中6 種致病菌 LAMP 檢測方法具有準確度高、靈敏度高、重復性好、特異性強、快速等優點，可廣泛應用于果蔬中致病菌的快速檢測，為生鮮果蔬行業的健康發展提供技術支持。