基于HRM技術的大白菜InDel標記高效檢測技術構建及其應用

張志剛，司立英，趙智中，王榮花，王立華，李巧云，劉栓桃

(1.山東省農業科學院蔬菜花卉研究所/國家蔬菜改良中心山東分中心/山東省設施蔬菜生物學重點實驗室,山東 濟南 250100; 2.聊城市東昌府區農業局,山東 聊城 252000)

插入/缺失 (Insertion/Deletion，簡稱InDel) 標記是基于全基因組重測序數據開發的針對基因組中核酸序列的插入或缺失而設計的PCR標記，是一種共顯性標記，具有較好的穩定性和豐富的多態性[1-3]，適合全基因組已經測序物種的種質多樣性分析、遺傳圖譜構建、QTL定位、基因型鑒定、雜交種真實性以及純度鑒定等方面的研究。InDel標記的檢測手段常根據插入/缺失序列的大小，而采用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或熒光毛細管電泳[3-5]，鮮見采用高分辨率熔解曲線技術檢測InDel標記的有關報道。

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)分析技術是近年來發展的一種用于突變掃描和基因分型的分子遺傳學分析方法。其原理主要是根據DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補性差異，致使任一雙鏈DNA分子在加熱變性時都有一個特定的熔解曲線性形狀。Ririe等[6]較早報道利用熒光染料對雙鏈 DNA 進行熔解曲線分析的研究，自2000年以來，利用熒光標記的探針大大提高了HRM檢測的準確性和靈敏度，可以有效檢測PCR產物間單個堿基的差異[7]。近年來，隨著飽和熒光染料的開發和使用，HRM檢測可以不使用成本較高的探針，而是在常規PCR反應體系中直接加入飽和熒光染料，PCR結束后在高分辨率曲線檢測設備上實現閉管直接分析，從而大大簡化試驗流程、降低試驗成本[8-10]。HRM技術已經在醫學和動植物單核苷酸多態性(SNP)分型方面得到非常廣泛的應用[10-14]，然而其在InDels標記檢測方面的應用還比較少。趙均良等[15]應用HRM技術檢測了一個水稻的SSR標記，該標記涉及四個堿基的差異，在非變性PAGE膠上難以區分，用HRM技術得到較好的分辨。蘇曉梅[16]利用HRM技術開發了一個番茄抗Ty1-InDel標記，利用該標記對83份番茄材料進行精準鑒定，取得良好效果。劉源霞等[17]將基于重測序技術開發的10個抗蘋果炭疽病InDel標記中的4個成功轉化成HRM標記，并用于對分離群體的鑒定。關于大白菜InDel標記的HRM分析技術尚未見報道。本試驗在前期研究基礎上，對已經鑒定的593對InDel標記[3]進行篩選和驗證，以獲得利用HRM分析技術可以實現穩定檢測的InDel標記，并利用這些標記對課題組創制的大白菜種質和大白菜雜交種進行鑒定，構建基于HRM技術的大白菜InDel標記的高通量檢測技術，為實現大白菜種質和雜交種純度的高效和高通量鑒定提供標記儲備和技術保障，也為InDel標記的廣泛應用提供新的途徑和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選擇前期已經完成全基因組重測序的大白菜自交系He102與06-247[3]作為基于HRM技術的InDel標記開發的標準內參材料。HRM高效檢測技術的構建則隨機選擇本課題組自行創制的大白菜種質90份和牛早秋1號雜交種，種子直播后于幼苗期取葉片備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照劉栓桃等[18]的方法，取大白菜幼嫩葉片組織約2 cm2置于2 mL螺口提取管中，加3粒直徑4 mm的陶瓷珠，再加800 μL TPS (100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 提取液，于自動研磨儀 (法國, Precellys24) 上5 000 r/min振蕩10 s，65℃恒溫箱保溫30～60 min，冷卻后4℃、12 000 r/min離心10 min；上清轉移至新的離心管中，加入等體積氯仿顛倒混勻以去除雜蛋白，然后4℃、12 000 r/min 離心10 min；上清用等體積的異丙醇沉淀DNA，DNA沉淀用100 μL 10 mmol/L 的Tris-HCl (pH 8.0) 溶解后，用NanoDrop 2000分光光度計測定 DNA 濃度，并將工作液濃度稀釋到10 ng/μL并于-20℃保存備用。

1.2.2 InDel標記篩選 參照張志剛等[3]的研究結果，從593對已經驗證的InDel標記中選擇，選擇標準參照劉栓桃等[4]的方法，即引物的擴增結果在06-247與He102中特異性好、僅有單一目的條帶、無雜帶干擾。從BRAD[19]數據庫中下載大白菜參考基因組序列(Brapa_sequence_v1.5), 根據引物所在位置以及重測序結果獲得差異目標片段序列，用軟件TMUtility_1.5預測序列的Tm值并計算每對引物擴增的差異片段的Tm差值，如果差值絕對值大于0.2℃則將該對引物確定為潛在的適宜HRM分型的InDel標記(潛在標記)，用于后續的梯度PCR驗證。

1.2.3 用于HRM分析的PCR擴增體系 標記的驗證在梯度PCR儀 (Eppendorf Mastercycler?nexus gradient) 上進行。PCR反應體系包含10 μL，有如下成分：2×Taq PCR Mastermix [天根生化科技(北京)有限公司產品，KT201-12]5 μL、10 pmol/L 正/反向引物各1 μL、LC Green 飽和熒光染料(Idaho, BCHM-ASY-0005) 1 μL、滅菌雙蒸水2 μL，以25 μL石蠟油覆蓋。循環參數為95℃預變性120 s；94℃ 30 s，60～68℃ (沿96孔板從A—H橫向平均遞增約1.28℃) 30 s，72℃ 10 s，42次循環；循環結束后25℃保存。PCR結束后在LightScanner-96(Idaho Technology Inc.)高分辨率熔解曲線分析儀上直接進行分析。采用小片段擴增法，用LightScanner Software Version 2.0 軟件進行自動分型。

1.2.4 基于HRM技術的InDel標記的高通量檢測體系及其應用 由于LightScanner-96一次最多只能檢測96個樣品，為了適應儀器的要求，降低檢測成本、提高檢測效率，在一塊96孔PCR板上只檢測一對引物，純系對照分別以He102與06-247為模板，雜合型對照以He102與06-247的DNA等量混勻物為模板，對照重復兩次以確保對照樣品被成功擴增。本研究將A1、B1和A2、B2分別設置為He102與06-247兩個標準對照品，將H11和H12兩個孔設置為雜合型對照，其余90個孔是待檢測樣品。PCR反應體系同上，退火溫度根據上述梯度PCR分析的結果確定，PCR結束后樣品的分析同上。

2 結果與分析

2.1 InDel標記的初步篩選

從已經驗證的593對InDel標記中，通過PAGE膠擴增條帶的識別，共篩選出特異性好、在06-247與He102中僅能擴增出單一條帶、變異位于編碼區的標記271對。對于這些篩選到的標記，逐一預測目標片段的Tm值以及Tm差值，其中有63對標記，其包含差異位點片段的Tm差值絕對值大于0.2℃，這63對標記的變異信息在10條染色體上的分布見表1。

表1 預測InDel標記在大白菜基因組中的分布

2.2 適宜HRM分型的InDel標記

由于飽和熒光染料的加入會改變引物的退火性質，因此對每對中選引物先進行梯度PCR擴增，以確定最佳退火溫度。引物IDA01058的梯度PCR擴增結果分型報告如圖1所示。報告主體由四部分組成，如圖1 A—D。其中圖1A是分析參數的簡要概括，有熔解曲線分析溫度設置的起止范圍(melt temperature range)、熒光信號捕獲的曝光時間(exposure)、基因分型(amplicon genotyping analysis parameter)參數，主要包括選擇的溫度范圍(temperature range )、靈敏度(sensitivity)的設置(默認是normal，即常規)、標準物質(standards)的選擇(本試驗以06-247與He102兩種材料在65.2℃即E5和E6的擴增產物熔解曲線為兩種標準基因型對照，即圖中的Use Internal Standards)。

圖1B表示本報告分析的樣品在96孔PCR板上的直觀排列，白色是剔除的樣品，第5列 (以He102為模板)和第6列(以06-247為模板)是本報告分析的樣品，E5(以He102為模板的擴增子熔解曲線指定為AA，系統以紅色表示)和E6(以06-247為模板的擴增子熔解曲線指定為BB，系統以灰色表示)是設定的內標基因型，軟件運行分型后，會自動按照給定的基因型標準給出分型結果，并按相應的顏色展示出來。如圖1B所示，凡是與E5熔解曲線相同的基因型，以紅色體現，而凡是與E6熔解曲線相同的基因型以灰色體現。與兩者都不匹配的，顯示未知并以綠色體現。

圖1C和圖1D分別是各樣品的熔解曲線形式和對應的峰值轉化圖，線條顏色與圖1B相對應。從分型結果可以看出，He102的擴增子在不同的退火溫度下擴增效率有顯著區別，雖然高于63.9℃的5個孔(D5—H5)的樣品都成功分型為一類，但從熔解曲線的形式直觀看，只有4個孔(E5—H5)的曲線高度擬合，其退火溫度在65.2℃及以上。而以06-247為模板的擴增子其擴增效率受退火溫度的影響較小，所有孔的樣品熔解曲線均高度擬合。綜合兩者的擴增結果，引物IDA01058的最佳退火溫度應在65.2～68.0℃之間。采用相同的方法分析其它62對引物，最終從中篩選到20對適合用高分辨率熔解曲線進行分析的引物，其退火溫度基本是在最初設計的退火溫度基礎上加5℃。

A:分型報告運行參數；B：分型報告的樣品在96孔板上的排列及其基因型鑒定結果；C：分析樣品的熔解曲線圖；D：分析樣品的熔解曲線峰值轉換圖。下圖同。

2.3 基于HRM技術的大白菜InDel標記高通量檢測體系及應用

采用鑒定的InDel標記IDA01061的正反向引物，在96孔PCR板上對90份種質進行鑒定，鑒定結果的自動分型報告如圖2所示。與圖1的結構相同，圖2A顯示了自動分型的基本參數，圖2B是分型結果在96孔板上的直觀體現，從中可以看出，3個標準樣品即純合基因型AA(A1、B1)、BB(A2、B2)以及雜合基因型AB (H11、H12)的擴增結果重復性非常好，這表明反應體系和反應條件非常適宜。其余90份待檢樣品全部得到精準鑒定，結果直觀展示在96孔板上。其中8份種質是純合AA基因型，72份種質是純合BB基因型，10份種質在該位點為雜合型。相應結果可以通過軟件導出為Excel表格，從而實現自動分型。圖2C和2D分別是均一化處理后的熔解曲線圖和熔解曲線峰值轉換圖。

采用標記IDA10055對牛早秋1號的雜交種純度進行鑒定，采用同樣的96孔板布局，鑒定結果的熔解曲線如圖3所示。在鑒定的90株幼苗中，雜合型AB有85株，雜合率94.4%，其余5株都是BB(母本)基因型，未檢出AA(父本)基因型。

圖2 基于HRM技術的InDel標記對大白菜種質的鑒定報告

AA、AB、BB指不同基因型。

圖3基于HRM技術的InDel標記對牛早秋1號>雜交種純度鑒定的熔解曲線

3 討論與結論

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting, HRM)分析技術是基于核酸小片段之間的GC含量差異而導致雙鏈核酸解鏈溫度差異的一門檢測技術。該技術具有三大優勢：一是操作簡單、快捷、節省時間成本；二是高通量、高靈敏度、高特異性、低成本且不受檢測位點的限制；三是閉管操作、無污染且DNA不受損傷，熔解分析后還可以進行凝膠電泳或測序分析[20]。HRM技術在大白菜突變體篩查方面的研究已有報道。劉夢洋等[21]采用HRM分析技術鑒定大白菜EMS誘變的突變體，篩選到單堿基突變材料，而有關利用HRM技術檢測插入/缺失突變及其在大白菜種質篩查和雜交種純度鑒定方面的應用尚未見報道。

本研究發現，HRM技術所需儀器LightScanner具有快速靈敏的特性，為保證熔解曲線平滑無雜峰，就要求PCR產物最好只有單一擴增產物。這一點我們在篩選標記時作了充分考慮，只選擇那些前期鑒定為單一擴增條帶的引物[3]，作為適宜HRM技術檢測的備選標記。另外，為了提高轉化的成功率，用特定的軟件對目標擴增產物的熔解溫度進行預測，從271對特異性好的標記中篩選到63對適宜進行HRM分析的標記，最終用PCR方法擴增標準材料，獲得了20對適宜用HRM技術分析的InDel標記，轉化成功率高達31.7%。梯度PCR的結果證實，加入飽和熒光染料后，引物的退火溫度普遍比預測的退火溫度升高5℃，這為后續應用HRM技術轉化其它標記提供了借鑒。

在構建基于HRM技術的高通量InDel標記檢測體系時，為了提高分析的準確率，同時簡化分析流程、降低試驗成本，本研究在每塊96孔PCR板上都設置兩種純合基因型對照以及兩種純合基因型模板等量混合后的雜合基因型對照，每個對照重復兩次，以確保對照樣品被成功擴增而獲得對照樣品的熔解曲線作為內設標準基因型對照，這樣便于用軟件對供試材料進行自動分型。本研究將開發的基于HRM技術的InDel標記用于大白菜種質鑒定和雜交種純度鑒定，取得良好分析效果。

無論是SNP標記還是InDel標記，一旦建立其HRM檢測技術，該標記便可用于分子標記應用的各個方面，諸如遺傳連鎖圖譜構建、關聯分析、分子標記輔助育種、種質精準鑒定、種質DNA指紋圖譜構建、雜交種純度和真實性鑒定等。本研究開發的20對基于HRM檢測技術的InDels標記可作為標記儲備用于上述分子標記鑒定方面。由于InDel標記在基因組中呈共顯性存在，且大多數位點只有兩種基因型[4]，因此非常適合高通量檢測和鑒定等方面的應用，其應用范圍和前景非常廣闊。