電針聯(lián)合健中愈瘍片對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型大鼠β- 內(nèi)啡肽及炎癥因子的影響

王建兵，劉二軍，張偉玲，趙甫剛

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 中醫(yī)科，河北 石家莊 050031)

胃潰瘍是臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)生主要與胃黏膜損傷和機(jī)體自身免疫防御機(jī)制失衡有關(guān)[1- 4]。近年來(lái)研究表明，針灸能夠減緩胃黏膜損傷并促進(jìn)其修復(fù)，有效地調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)潰瘍面愈合，針灸胃經(jīng)穴位能夠防治胃黏膜損傷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，“足三里”是足陽(yáng)明胃經(jīng)的主要穴位之一，電針刺“足三里”能增加血漿和胃體黏膜中降鈣素基因相關(guān)肽的含量[6]。另有研究表明，電針刺“梁門(mén)穴”對(duì)胃潰瘍愈合率最高[7]。健中愈瘍片主要由黨參、白術(shù)、黃芪、救必應(yīng)、延胡索、蒲公英、珍珠粉、甘草等組成，能夠提高胃潰瘍愈合率，降低炎癥因子水平，具有改善胃潰瘍愈合質(zhì)量的作用[8- 9]。本研究探討電針聯(lián)合灌服健中愈瘍片對(duì)乙酸誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠下丘腦與血漿β- 內(nèi)啡肽及血清中細(xì)胞炎癥因子水平的影響，探討兩種方法聯(lián)合使用對(duì)胃潰瘍的療效及其保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 β- 內(nèi)啡肽酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒(美國(guó)TSZ公司生產(chǎn))；白細(xì)胞介素- 6(IL- 6)、白細(xì)胞介素- 8(IL- 8)、腫瘤壞死因子- α(TNF- α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(德國(guó)IBL公司生產(chǎn))；健中愈瘍片(九芝堂股份有限公司生產(chǎn))；戊巴比妥鈉(北京沃比森科技有限公司)；肝素(上海昊化化工有限公司)；乙醇分析純，水為超純水。G6805- 2治療儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；-80 ℃冰箱(北京華興科儀科技發(fā)展有限公司)；低溫離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)SD雄性大鼠50只，體重(200±20) g，4周齡，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫(23±2) ℃，相對(duì)濕度58%，自由飲水和喂食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 胃潰瘍動(dòng)物模型的制備 大鼠于造模前禁食12 h，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(2 ml·kg-1)麻醉，腹壁剪毛，消毒，于劍突下縱向切開(kāi)腹壁約2 cm，在胃前壁體竇交接處漿膜面用乙酸(假手術(shù)組大鼠以生理鹽水代替乙酸)浸泡過(guò)的5 mm濾紙緊貼2次，30 s·次-1，用生理鹽水沖洗，分層縫合腹壁，注射抗生素。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥[10]將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即假手術(shù)組、模型組、電針組、藥物組和聯(lián)合組，每組10只。各組大鼠按照“1.2.1”項(xiàng)下方法造模。其中假手術(shù)組大鼠未進(jìn)行乙酸濾紙刺激，其他操作相同。電針組與聯(lián)合組穴分別選雙側(cè)足三里和梁門(mén)穴，接電極，連接治療儀(頻率2 Hz，強(qiáng)度3 V，波寬1 ms)，持續(xù)30 min，每天1次，連續(xù)2周。藥物組與聯(lián)合組灌胃給予健中愈瘍片0.5 g·kg-1(按成人給藥量的大鼠體表面積換算后的劑量)，每天1次，連續(xù)2周。假手術(shù)組與模型組于每天給予等量生理鹽水。

1.2.3 樣本的采集及指標(biāo)測(cè)定 各組大鼠禁食24 h后，斷頭取血、取胃。血液分別置于肝素抗凝和不含肝素的離心管中，于4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，分別收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存，分別用于測(cè)定血漿β- 內(nèi)啡肽和IL- 6、IL- 8、TNF- α的含量。處死大鼠后冰臺(tái)上迅速分離下丘腦，稱(chēng)重，加入1 mol·L-1鹽酸1 ml，制成勻漿，室溫放置100 min充分溶解生物活性肽，加入1 mol·L-1氫氧化鈉1 ml中和，于3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，用于測(cè)定下丘腦β- 內(nèi)啡肽。沿胃大彎剪開(kāi)，取胃，以生理鹽水沖洗，用游標(biāo)卡尺測(cè)定潰瘍?cè)畲笮。捎肎uth法計(jì)算黏膜損傷指數(shù)[11]和潰瘍抑制率，潰瘍抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組潰瘍指數(shù)均值/模型組潰瘍指數(shù)均值)]×100%。以潰瘍?cè)畹淖铋L(zhǎng)徑為中心切取含潰瘍邊緣約3 mm胃組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，置于載玻片上進(jìn)行HE染色。

1.2.4 下丘腦與血漿β- 內(nèi)啡肽的測(cè)定 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品、100 μl“1.2.3”項(xiàng)下制得樣本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中，混勻，封孔，37 ℃孵育約90 min，洗板，生物素及辣根過(guò)氧化物酶溫育，顯色后于多功能酶標(biāo)儀450 nm處讀吸光度，計(jì)算含量。

1.2.5 IL- 6、IL- 8、TNF- α的檢測(cè) 按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，方法同“1.2.4”項(xiàng)，用多功能酶標(biāo)儀450 nm下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胃黏膜病理組織觀察

與假手術(shù)組小鼠比較，模型組胃潰瘍面積明顯，黏膜層薄，缺損嚴(yán)重，下層可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(P<0.05)。電針組、藥物組和聯(lián)合組胃黏膜損傷明顯修復(fù)，黏膜層較厚，炎性細(xì)胞明顯較少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠潰瘍指數(shù)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組、藥物組和聯(lián)合組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)顯著降低(P<0.05)。聯(lián)合組大鼠的Guth潰瘍損傷指數(shù)比電針組和藥物組低(P<0.05)，潰瘍抑制率比電針組與藥物組高(P<0.05)。電針組、藥物組大鼠Guth潰瘍損傷指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

組 別n炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量假手術(shù)組109.52±1.36模型組1040.53±8.36a電針組1028.52±5.75bc藥物組1023.75±4.59bc聯(lián)合組1018.52±3.75b

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

組 別nGuth潰瘍損傷指數(shù)潰瘍抑制率/%假手術(shù)組100—模型組1051.15±8.34a—電針組1011.63±1.84bc77.27c藥物組109.68±1.37bc82.08c聯(lián)合組105.64±1.76b88.98

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

2.3 各組大鼠血漿中β- 內(nèi)啡肽含量的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿β- 內(nèi)啡肽含量顯著降低，下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠血漿β- 內(nèi)啡肽含量顯著上升，下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著下降(P<0.05)。 聯(lián)合組大鼠下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量比電針組和藥物組低(P<0.05)，電針組大鼠下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量比藥物組低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 各組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TN F- α含量的比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組、藥物組和聯(lián)合組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量顯著降低(P<0.05)。聯(lián)合組大鼠血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量比電針組和藥物組低(P<0.05)。藥物組大鼠血清IL- 6、TNF- α含量比電針組低(P<0.05)，兩組IL- 8含量不存在顯著差異。見(jiàn)表4。

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聯(lián)合組比較，cP<0.05

3 討 論

引起胃潰瘍的因素主要有胃酸過(guò)多、胃黏膜保護(hù)作用減弱和Hp感染，其中Hp感染是引起胃潰瘍發(fā)生的最主要原因[12]。Hp作為一種革蘭陰性桿菌，導(dǎo)致機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起IL- 6、IL- 8等炎性細(xì)胞因子含量上升，使下丘腦調(diào)控作用發(fā)生障礙，導(dǎo)致胃黏膜免疫系統(tǒng)紊亂，損傷胃組織，引發(fā)胃黏膜屏障受損及病變。β- 內(nèi)啡肽為阿片肽類(lèi)免疫活性物質(zhì)，主要產(chǎn)生于下丘腦和垂體，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激后其水平發(fā)生變化，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，其作用機(jī)制主要通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)完成[13]。

電針主要通過(guò)調(diào)節(jié)垂體- 下丘腦- 腎上腺軸，使代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生療效。足三里穴和梁門(mén)穴為足陽(yáng)明胃經(jīng)的代表穴，足三里穴為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴和胃的下合穴，能提高機(jī)體免疫，是目前胃潰瘍臨床治療應(yīng)用最廣、研究最多的一個(gè)穴位。梁門(mén)穴位于胃竇部，是胃部局部病變的首選穴位之一，對(duì)胃腑功能的寒熱虛實(shí)疾病包括腹痛、泄瀉、消化性潰瘍等具有療效，為足陽(yáng)明胃經(jīng)經(jīng)氣出入的重要門(mén)戶(hù)，使胃腑功能受納、腐熟水谷功能得以改善。足三里、梁門(mén)穴均為足陽(yáng)明胃經(jīng)穴，足三里穴配伍梁門(mén)穴，既重視局部，又不忽略整體，達(dá)到調(diào)和脾胃、暢通氣機(jī)的功效，電針刺二穴對(duì)治療胃潰瘍具有顯著療效[14]。健中愈瘍片由黨參、黃芪、白芍、延胡索等中藥組成，方中黨參、黃芪具有健脾益氣的作用，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)抗炎作用；白芍柔肝止痛，能夠降低炎癥因子分泌，減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃黏膜組織修復(fù)；延胡索具有活血行氣止痛的作用，能夠抑制胃酸分泌。

本次實(shí)驗(yàn)觀察了胃潰瘍模型大鼠血漿與下丘腦β- 內(nèi)啡肽和炎性細(xì)胞因子IL- 6、IL- 8、TNF- α的含量變化情況，結(jié)果表明，模型組下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量顯著高于假手術(shù)組，主要原因是模型組大鼠注射乙酸后，在應(yīng)激狀態(tài)下啟動(dòng)防御機(jī)制，通過(guò)激活下丘腦- 垂體- 腎上腺軸促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素及β- 內(nèi)啡肽的釋放，導(dǎo)致胃潰瘍大鼠模型下丘腦中β- 內(nèi)啡肽含量升高。電針與藥物單獨(dú)治療、聯(lián)合治療均能顯著降低胃潰瘍小鼠下丘腦中β- 內(nèi)啡肽含量和血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量，升高血漿中β- 內(nèi)啡肽含量，兩種方法結(jié)合療效更顯著。下丘腦β- 內(nèi)啡肽與血清IL- 6、IL- 8、TNF- α含量呈正相關(guān)，說(shuō)明下丘腦β- 內(nèi)啡肽的含量下降，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡抑制細(xì)胞炎癥因子的合成，并使其水平下降，修復(fù)失衡的免疫功能，保護(hù)胃黏膜。電針刺足三里和梁門(mén)穴治療可以有效降低下丘腦β- 內(nèi)啡肽水平，增加血漿β- 內(nèi)啡肽含量，使下丘腦β- 內(nèi)啡肽向血漿釋放，與文獻(xiàn)報(bào)道[15]結(jié)果一致。健中愈瘍片組方中多種中藥配伍起協(xié)同作用，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫平衡發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)消化道修復(fù)，針對(duì)胃潰瘍的病因起綜合療效。電針治療能夠降低下丘腦β- 內(nèi)啡肽含量，健中愈瘍片可有效抑制IL- 6、IL- 8、TNF- α的表達(dá)，電針與健中愈瘍片聯(lián)合使用共同促進(jìn)機(jī)體免疫功能平衡調(diào)節(jié)，可有效降低胃黏膜組織損傷，發(fā)揮治療胃潰瘍的作用。