枸杞多糖聯(lián)合順鉑對(duì)肝癌小鼠抑瘤作用及其對(duì)免疫功能的影響

王自闖，陳小永，張娟

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，占常見惡性腫瘤發(fā)病率第4位，肝癌患者死亡率極高，占病死率的前3位，嚴(yán)重威脅腫瘤患者的生命[1- 5]。目前對(duì)肝癌常用藥物化療，其中順鉑是一種廣泛被用于化療的鉑制劑，具有較強(qiáng)毒副作用，易對(duì)機(jī)體免疫功能造成損傷，臨床上對(duì)其使用劑量有嚴(yán)格要求[6]。中藥枸杞子為茄科植物寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果實(shí)，主要?dú)w肝經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效。枸杞子中含有豐富的枸杞多糖，研究表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用[7]和保肝作用[8]，且對(duì)肝癌具有明顯的抑制作用[9- 10]。近年來，有報(bào)道稱中藥成分中的多糖類在減輕順鉑毒性方面表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠有效減輕順鉑的毒副作用[11]。因此，本研究主要通過制備肝癌小鼠模型，觀察枸杞多糖聯(lián)合順鉑對(duì)肝癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)IL- 2、TNF- α水平和T淋巴細(xì)胞亞群的影響，為枸杞的資源開發(fā)利用和臨床上肝癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平(德國(guó)賽得利斯有限公司)；冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)；Milli- Q超純水機(jī)(默克密理博)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明小鼠70只，雄性，6周齡，體重18～20 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鼠源肝癌細(xì)胞株H22腹水癌小鼠，由中國(guó)科學(xué)院上海分院提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，濕度為50%～60%，飼養(yǎng)條件均符合SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求。

1.1.3 試劑 枸杞多糖(40%，西安天豐生物科技有限公司)；順鉑(山東齊魯制藥廠)；IL- 2、TNF- α ELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；小鼠CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體(熒光素標(biāo)記，美國(guó)Ebioscience公司)；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 肝癌模型的建立 抽取H22肝癌小鼠腹水，稀釋至細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·ml-1的混懸液。取細(xì)胞懸液0.2 ml，注射于健康昆明小鼠右前肢腋窩皮下[8]。本次造模小鼠60只，成功造模52只，成模率86.67%。

1.2.2 分組與給藥 選取40只造模成功的雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組、順鉑組、枸杞多糖組、聯(lián)合組，每組10只，另取未造模的昆明小鼠10只作為對(duì)照組。順鉑組腹腔注射順鉑(2.0 mg·kg-1)，枸杞多糖組灌胃給予枸杞多糖(20 mg·kg-1)，聯(lián)合組腹腔注射順鉑(2.0 mg·kg-1)，8 h后灌胃給予枸杞多糖(20 mg·kg-1)。成功造模后第8天開始給藥，給藥劑量參考臨床劑量及2015年版《中國(guó)藥典》“枸杞子”項(xiàng)下用量，通過人與動(dòng)物的體表面積換算，連續(xù)給藥14 d，于第15天測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 臟器指數(shù)與腫瘤抑制率的計(jì)算 各組小鼠于給藥后第15天稱重，眼眶取血后頸椎脫臼處死，分離腫瘤，稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。公式如下：腫瘤抑制率=(模型組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/模型組瘤重×100%。分離脾臟、胸腺組織，稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。計(jì)算公式為：臟器指數(shù)(mg·g-1)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.2.4 小鼠外周血IL- 2和TNF- α的含量檢測(cè) 各組小鼠眼眶取血0.5 ml，加入肝素，采用ELISA法測(cè)定IL- 2和TNF- α含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 小鼠外周血T細(xì)胞亞群的測(cè)定 各組小鼠眼眶取血0.5 ml，加入肝素，取100 μl全血，分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體，避光靜置，約15 min后加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，1 500 r·min-1離心20 min。棄去上清液，加入PBS液，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較

與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，順鉑組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，枸杞多糖組和聯(lián)合組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著升高(P<0.05)；聯(lián)合組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于順鉑組(P<0.05)。見表1。

表1各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較(n=10)

Tab1Thecomparsionofspleenindexesandthymusindexesofdifferentgroups(n=10)

組 別脾臟指數(shù)/mg·g-1胸腺指數(shù)/mg·g-1對(duì)照組7.54±1.021.85±0.34模型組6.47±0.96a1.13±0.12a順鉑組5.22±1.83b0.84±0.37b枸杞多糖組8.25±1.13bc2.54±0.32bc聯(lián)合組7.73±0.9bc2.27±0.46bc

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05

2.2 各組小鼠腫瘤重量和腫瘤抑制率的比較

順鉑組、枸杞多糖組、聯(lián)合組小鼠的腫瘤重量均顯著低于模型組(P<0.05)，3組小鼠腫瘤抑制率均達(dá)到30%以上，達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)[9]。聯(lián)合組小鼠的腫瘤重量顯著低于順鉑組與枸杞多糖組(P<0.05)，聯(lián)合組小鼠腫瘤抑制率為55.19，明顯高于順鉑組與枸杞多糖組。見表2。

表2各組小鼠腫瘤重量和腫瘤抑制率比較(n=10)

Tab2Thecomparsionoftumorweightsandtumorinhibitionratesofdifferentgroups(n=10)

組 別腫瘤重量/g腫瘤抑制率/%對(duì)照組——模型組1.83±0.38—順鉑組1.02±0.21a44.25枸杞多糖組1.23±0.13ab32.77聯(lián)合組0.82±0.16abc55.19

與模型組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與枸杞多糖組比較，cP<0.05

2.3 各組小鼠 IL- 2、TNF- α水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的IL- 2、TNF- α水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，順鉑組小鼠IL- 2、TNF- α水平顯著降低(P<0.05)，枸杞多糖組、聯(lián)合組的IL- 2、TNF- α水平顯著升高(P<0.05)；與順鉑組比較，聯(lián)合組小鼠的IL- 2、TNF- α水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3各組小鼠IL-2、TNF-α水平的比較(n=10)

Tab3ThecomparsionofIL-2、TNF-αofdifferentgroups(n=10)

組 別IL-2水平/pg·ml-1TNF-α水平/pg·ml-1對(duì)照組116.65±21.33123.83±26.33模型組73.21±18.56a81.04±20.13a順鉑組60.08±10.72b67.35±13.88b枸杞多糖組115.38±30.82bc118.53±31.28bc聯(lián)合組105.02±26.07bc111.72±17.38bc

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05

2.4 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比，CD4+T/CD8+T值均顯著降低(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，順鉑組CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比，CD4+T/CD8+T值均顯著降低(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比顯著升高(P<0.05)；枸杞多糖組、聯(lián)合組小鼠的CD3+、CD4+、CD4+T/CD8+T值均顯著升高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)。與順鉑組比較，聯(lián)合組小鼠的CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比，CD4+T/CD8+T 值均顯著升高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)。見表4。

3 討 論

順鉑是目前臨床上廣泛應(yīng)用于肝癌化療的藥物[12]。順鉑能使肝癌細(xì)胞缺血、壞死，但其選擇性差，且具有免疫抑制作用，在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)正常組織細(xì)胞與臟器造成損傷，影響機(jī)體免疫功能[13]。中藥枸杞子歸肝經(jīng)，且其活性成分枸杞多糖有抑制肝臟腫瘤生長(zhǎng)的藥理作用。研究表明，枸杞子的有效成分枸杞多糖能夠保護(hù)脾臟、胸腺等免疫器官，提高免疫能力，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原的免疫殺傷力，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能平衡[14]。

表4各組小鼠CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T比較(n=10)

Tab4ThecomparsionofCD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+Tofdifferentgroups(n=10)

組 別CD3+T/%CD4+T/%CD8+T/%CD4+T/CD8+T對(duì)照組63.64±8.4535.48±2.1826.55±4.921.29±0.42模型組57.42±5.67a27.65±3.31a30.47±2.65a0.95±0.30a順鉑組52.54±6.85b23.25±1.85b32.97±3.54b0.61±0.39b枸杞多糖組63.16±3.05bc35.62±1.44bc27.02±3.85bc1.32±0.27bc聯(lián)合組61.94±5.33bc34.06±2.34bc27.60±4.24bc1.23±0.33bc

與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05

本研究主要通過建立肝癌小鼠模型，將枸杞多糖與順鉑聯(lián)合使用，比較與單用順鉑或枸杞多糖治療作用的差異，通過觀察脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腫瘤抑制率、IL- 2和TNF- α細(xì)胞因子水平，結(jié)合T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況，探討枸杞多糖聯(lián)合順鉑抑制肝臟腫瘤生長(zhǎng)的免疫機(jī)制。脾臟作為機(jī)體最大的外周免疫器官，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，胸腺為中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育的場(chǎng)所，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)可以直觀反映機(jī)體免疫功能。研究結(jié)果顯示，順鉑組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著低于模型組小鼠，表明給予順鉑治療對(duì)肝癌小鼠的免疫器官造成損傷。聯(lián)合組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與順鉑組小鼠比較顯著升高，表明枸杞多糖對(duì)順鉑導(dǎo)致的免疫器官損傷具有一定保護(hù)作用。T淋巴細(xì)胞主要分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個(gè)亞群，CD4+T細(xì)胞為輔助性T淋巴細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞為抑制性T淋巴細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子作用下，CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞起殺傷作用，CD4+T和CD8+T細(xì)胞相互制約，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡[15]。IL- 2作為淋巴活性細(xì)胞因子，主要由CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，TNF- α為腫瘤壞死因子,具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，在癌癥治療中發(fā)揮重要作用。研究表明，肝癌患者外周血IL- 2、TNF- α水平顯著降低[16]。本研究結(jié)果顯示，順鉑組小鼠IL- 2、TNF- α水平，CD3+T、CD4+T細(xì)胞百分比，CD4+/CD8+T細(xì)胞值均顯著低于模型組小鼠，表明順鉑對(duì)免疫功能有抑制作用。與順鉑組小鼠相比，聯(lián)合組能顯著提高IL- 2、TNF- α、CD3+T、CD4+T淋巴細(xì)胞水平，提高CD4+/CD8+T值，降低CD8+T細(xì)胞水平，說明枸杞多糖能夠減少順鉑對(duì)機(jī)體的免疫損傷，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群平衡，促進(jìn)IL- 2、TNF- α分泌，使IL- 2、TNF- α恢復(fù)正常水平，進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷與抑制作用。由此可見，枸杞多糖與順鉑聯(lián)用能夠通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群平衡，使細(xì)胞生長(zhǎng)因子恢復(fù)到正常水平，減輕順鉑對(duì)免疫功能的抑制，提高腫瘤抑制率。