骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液在未成熟鼠腦損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用

疏佳萍，柏文華，蔣犁

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 兒科，江蘇 南京 210009)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)具有高度增殖及多向分化潛能，可分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元樣細胞等[1]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植可以改善缺氧缺血腦損傷的炎癥反應(yīng)[2]，但是干細胞的直接移植存在細胞變異分化瘤變可能及形成細胞栓等問題。本研究旨在通過定向注射BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型，檢測炎癥因子分泌濃度，進一步探討B(tài)MSCs旁分泌作用干預(yù)早產(chǎn)兒腦損傷的作用機制，為干細胞技術(shù)應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰酶(EDTA，美國Gibco公司)，MEM培養(yǎng)基、青霉素- 鏈霉素雙抗、PBS(美國Hyclone公司)，HE相關(guān)試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重80～100 g,4～5周齡，用于分離培養(yǎng)BMSCs;新生3 d SD大鼠，用于制作早產(chǎn)兒腦損傷模型;所有實驗動物均由南京祥鴻生物有限公司提供，實驗動物的處理方法均符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs原代分離培養(yǎng)及純化 全骨髓貼壁法[3]培養(yǎng)BMSCs,水合氯醛麻醉大鼠，75%酒精浸泡消毒5 min后移至超凈臺，通風(fēng)櫥內(nèi)無菌條件下取雙側(cè)鼠股骨、脛骨浸入PBS中。1 ml注射器抽取PBS反復(fù)沖洗至髓腔發(fā)白，沖洗過程中可見紅色渾濁液體流出。收集混合液，室溫條件下1 500×g離心7 min,棄去上清液，用完全培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%雙抗)重懸沉淀，細胞計數(shù)，按照4 000 cm-2接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后首次半量換液，每隔48～72 h全量換液，待細胞融合70%～80%，0.25%EDTA消化，等量完全培養(yǎng)基中和EDTA，1 500×g離心7 min收獲細胞，完全培養(yǎng)基重懸細胞，1∶2或1∶3接種于新培養(yǎng)瓶。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況。取P3代細胞待用，BMSCs鑒定參考本實驗室所發(fā)表文章[4]。

1.2.2 動物模型制備、實驗分組及取材 模型制作：改良Longa線栓法栓塞左側(cè)頸總動脈，腦缺血1 h后進行混合氣(94%N2+6%O2)通氣2 h造缺氧模型，術(shù)后24 h參考Bederson JB評分行神經(jīng)功能缺損評分，評分2～4分視為模型制作成功。分組：將新生3 d SD大鼠隨機分為對照組(A組)、PBS干預(yù)組(B組)和上清液干預(yù)組(C組)，每組8只。A組僅制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，無其他干預(yù)；B組制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，術(shù)后側(cè)腦室定向注射PBS；C組制作早產(chǎn)兒缺氧缺血腦損傷模型，術(shù)后側(cè)腦室定向注射培養(yǎng)BMSCs的上清液。實驗取材：七氟烷吸入麻醉后取乳鼠全腦作病理切片材料，取部分乳鼠左側(cè)腦超聲波下所制腦勻漿作ELISA實驗材料。

1.2.3 HE染色觀察各實驗組大腦病理改變 (1)石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、75%酒精5 min，自來水洗；(2)蘇木素染色：蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗；(3) 伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5 min；(4)脫水封片：切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、 二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；(5)顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.4 檢測白細胞介素- 6(interleukin- 6, IL- 6)及轉(zhuǎn)化生長因子- β(transforming growth factor- β,TGF- β)分泌濃度 (1)準備所有的試劑和標準品；(2)復(fù)孔加入100 μl 2倍倍比稀釋的標準品，空白孔加入100 μl 1× 檢測緩沖液，樣本孔加入50 μl 1×檢測緩沖液和50 μl預(yù)稀釋的樣本；(3)每孔加入50 μl稀釋的檢測抗體，室溫孵育1.5 h，洗滌6次；(4)每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min，洗滌6次；(5)每孔加入100 μl顯色底物，避光，室溫孵育5～30 min；(6)每孔加入100 μl終止液，30 min內(nèi)在450 nm波長檢測OD值，參考波長630 nm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，對于重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析進行比較，并且采用bonferroni的兩兩比較進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)48 h內(nèi)由于培養(yǎng)基渾濁無法觀察細胞形態(tài)，96 h后細胞數(shù)量減少，形態(tài)較小，有少量突起，呈小梭型，聚集生長。7～8 d后細胞融合70%～80%。傳代后細胞生長迅速，12 h后細胞可基本全部貼壁、伸展、均勻分布，細胞呈梭型、漩渦狀生長。傳至第3代細胞融合80%～90%時，可見細胞生長良好，細胞呈梭型、漩渦狀生長(圖1)。收集第3代培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基，1 500×g離心7 min，棄去脫落細胞及培養(yǎng)基中殘物等沉淀，取上清液供本研究使用。

圖1BMSCs形態(tài)×100

2.2 大腦組織病理切片

HE染色結(jié)果顯示A組側(cè)腦室擴張，海馬區(qū)結(jié)構(gòu)變異明顯；C組側(cè)腦室擴張程度較A組小，海馬結(jié)構(gòu)變異程度不明顯。見圖2。

2.3 不同時間點各組腦勻漿上清液IL- 6、TGF- β含量的比較

B組與A組相比， 1、3、5 d IL- 6含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，C組各時間點的IL- 6含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明BMSCs上清液干預(yù)有效。同一組在不同時間點與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組3 d與5 d比較， IL- 6含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖2第5天時各實驗組側(cè)腦室鏡下染色形態(tài)HE×100

表1不同時間點各組IL-6含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05；與同組3 d 比較，cP<0.05

B組與A組相比，各時間點的TGF- β表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組各時間點的TGF- β含量均低于A、B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；同一組在不同時間點與該組第1天相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2不同時間點各組TGF-β含量比較pg·ml-1

與C組比較，aP<0.01；與同組1 d比較，bP<0.05

3 討 論

近年來，隨著早產(chǎn)兒發(fā)生率的逐漸上升[5]，以及早產(chǎn)兒存活率的顯著提高，早產(chǎn)兒腦損傷的發(fā)生率也隨之增加，其中腦白質(zhì)損傷(white matter injury, WMI)是最重要的腦損傷類型[6]，其病因和發(fā)病機制極其復(fù)雜，常見于胎齡24～32周的早產(chǎn)兒[7]。WMI可導(dǎo)致腦癱，認知、行為、視覺和聽力障礙等[8- 9]。迄今國內(nèi)外對早產(chǎn)兒WMI的治療方法仍處于研究階段，其生存質(zhì)量的改善是國際性的重點攻克目標。

BMSCs是存在于骨髓中的非造血成體干細胞，具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可向軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞等方向進行分化[10]。 因此 BMSCs 移植入體內(nèi)分化為功能細胞替代受損細胞被認為是移植治療的主要機制。但是近年來,隨著對 BMSCs 生物學(xué)作用研究的深入,學(xué)術(shù)界認為 BMSCs 參與組織損傷修復(fù)可能通過至少兩種方式：分化替代機制和旁分泌機制,并且 BMSCs 的旁分泌機制可能在組織修復(fù)中發(fā)揮著比分化替代更為關(guān)鍵的作用[11]。BMSCs旁分泌的生物活性因子主要有生長因子及其受體如VEGF,細胞因子和趨化因子等[12]。

機體多種細胞均可分泌非活性狀態(tài)的TGF- β，一般在細胞分化活躍的組織常含有較高水平的TGF- β。TGF- β的生物學(xué)功能研究主要在炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育等方面[13]，近年來發(fā)現(xiàn)TGF- β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs上清液移植后第5天，TGF- β表達較PBS干預(yù)組明顯上升，說明BMSCs上清液的神經(jīng)保護作用可能與改變TGF- β的表達量有關(guān)。可能由于個體差異導(dǎo)致TGF- β含量不同，也可能由于TGF- β隨炎癥刺激而激發(fā)神經(jīng)免疫反應(yīng)的增高，造成各時間點TGF- β含量不同。說明BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型后可以促進保護性因子TGF- β的分泌。

目前，已有研究明確顯示TGF- β在成人腦組織中具有神經(jīng)保護功能[14]，但其在早產(chǎn)兒腦損傷中的研究尚未闡明。合理掌握和應(yīng)用TGF- β保護和損傷作用的分界點，既要發(fā)揮神經(jīng)保護作用，同時抑制其損傷效應(yīng)，這是未來早產(chǎn)兒腦損傷新靶點治療的研究方向。

IL- 6調(diào)節(jié)多種細胞的生長與分化，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用。神經(jīng)炎癥是腦損傷的重要病理表現(xiàn)，形成的過度炎癥級聯(lián)反應(yīng)破壞血腦屏障，損傷腦神經(jīng)細胞并影響損傷部位生理功能[15]。本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后第3天上清液干預(yù)組IL- 6較PBS干預(yù)組明顯下降，說明上清液的神經(jīng)保護作用可能與抑制IL- 6的釋放有關(guān)。可能由于個體差異造成IL- 6含量不同，也可能由于炎癥因子激發(fā)體內(nèi)保護機制，造成各時間點IL- 6含量不同。初步預(yù)示BMSCs上清液干預(yù)腦損傷模型后可以抑制促炎因子IL- 6的分泌。

綜上所述，側(cè)腦室立體定向移植BMSCs上清液可改善腦損傷后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可能與移植BMSCs上清液后腦組織中IL- 6和TGF- β表達水平的變化有關(guān)。但移植后BMSCs上清液抑制IL- 6表達、促進TGF- β表達的機制尚不清楚，可能與BMSCs通過旁分泌作用使上清液內(nèi)含有營養(yǎng)性因子或傳遞相關(guān)炎癥信號的物質(zhì)有關(guān)，我們后續(xù)將進一步實驗探索。