肺炎患者體內肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素分析

楊文平，劉爽，王海濱，亓玉心，劉長江，周玉法

(萊蕪市人民醫院 呼吸內科，山東 萊蕪 271100)

近年來，隨著醫學技術的發展，機械通氣技術、導管技術等逐漸發展，已成為臨床中常見的治療技術。但由此而引發的感染性疾病也日漸增多，已成為全球突出性的醫療衛生問題。同時，革蘭陰性菌的感染率也逐漸升高，其中醫務人員最為重視的屬肺炎克雷伯菌，這種腸桿菌科克雷伯菌屬細菌已成為醫院及社區中引發感染性疾病最多的菌種[1- 3]。克雷伯菌可引發人類嚴重的腸道疾病，亦可導致肺炎、敗血癥、尿道炎、外源性感染等疾病[4- 5]。臨床上常采用廣譜抗生素類藥物殺滅肺炎克雷伯菌[6- 7]，但抗生素的濫用又使得肺炎克雷伯菌的耐藥性提高，已有多篇文獻對肺炎克雷伯菌的耐藥基因和基因亞型進行了報道[8- 9]。使用抗生素對肺炎克雷伯菌進行抑制還可能出現菌血癥和內毒素血癥兩個致死因素[10]。通過提高抗菌藥物治療的有效率和敏感性，菌血癥的發生率已顯著降低[11]。但因細胞內毒素的釋放而引發的休克癥狀和患者死亡率仍居高不下，有研究表明這種現象的發生與細菌內毒素進入人體血液循環系統有關[12]。同時，不同的抗菌藥物所引發的內毒素釋放量也有顯著差異。因此，本研究致力于探索肺炎患者體內肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，為臨床治療中合理選擇抗菌藥物、制定治療方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 EDS- 99細菌內毒素檢測儀(北京金山川科技發展有限公司)；鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號0110152)，細菌內毒素工作標準品(中國藥物生物制品檢定所，批號2015- 7)，細菌內毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司，批號0401130)。

1.1.2 藥物 乳酸環丙沙星注射液(廣州南新制藥有限公司，批號CFI 00303)，注射用美羅培南(日本住友制藥株式會社，批號EK 147)，頭孢曲松鈉(上海羅氏制藥有限公司，批號SH 0359)，硫酸慶大霉素注射液(華北制藥集團制劑有限公司，批號030801)。

1.1.3 菌株 肺炎克雷伯菌CMCC(B)46117，我院微生物室保存株。

1.2 方法

1.2.1 肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素的Logistic回歸分析 查閱文獻，確定可能對肺炎克雷伯菌釋放內毒素產生影響的因素進行單因素和Logistic回歸分析。可能影響因素有稀釋濃度、培養時間、抗菌藥物聯用和不同培養基。

1.2.2 標準株菌液的制備 在M- H瓊脂平板上接種肺炎克雷伯菌，在35 ℃培養箱中孵育12 h后，挑取單個菌落，接種于5 ml M- H肉湯中，直至渾濁，麥氏比濁后含菌量為106～9cfu·ml-1。

1.2.3 體外藥物敏感實驗 根據二倍稀釋法分別測定4種抗菌藥物及兩種聯合抗菌藥物(環丙沙星+美羅培南、頭孢曲松鈉+慶大霉素)的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

1.2.4 標準曲線的制作 使用細菌內毒素檢查用水將標準品分別稀釋至5.00 EU·ml-1、0.50 EU·ml-1和0.05 EU·ml-1，取相同劑量與鱟試劑混合后進行檢測。

1.2.5 內毒素釋放的測定 根據實驗要求，設定抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度梯度、培養時間、抗菌藥物單用或聯用，培養結束后取出樣品稀釋10 000倍，采用動態比濁法鱟實驗測定內毒素釋放量。

1.3 統計學處理

對本實驗的所有檢測數據進行統計學分析，分析軟件使用SPSS 21.0，肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素運用Logistic回歸分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺炎克雷伯菌釋放內毒素影響因素的單因素分析

通過單因素分析可知，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度、培養時間和兩種抗菌藥物聯用是影響因素，但肺炎克雷伯菌培養基的不同不是影響因素，見表1。

表1肺炎克雷伯菌釋放內毒素影響因素的單因素分析

Tab1Oneway-ANOVAoffactorsaffectingendotoxinreleasefromKlebsiellapneumoniae

相關因素內毒素釋放量/EU·ml-1F/t值P值抗菌藥物稀釋濃度 1倍MIC1 419±284 10倍MIC703±1034.1050.009 100倍MIC584±91培養時間 4 h及以下592±92-3.7170.014 4 h以上1 200±268抗菌藥物聯用 是348±24-11.146<0.001 否806±67M-H肉湯培養基 是1 583±2450.4270.687 否1 502±219

2.2 肺炎克雷伯菌釋放內毒素影響因素的Logistic回歸分析

通過Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度、培養時間和兩種抗菌藥物聯用是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，見表2。

2.3 各抗菌藥物單用和聯用的MIC

通過體外藥物敏感實驗得出各抗菌藥物單用或聯用的MIC分別為：環丙沙星0.030 3 mg·L-1，美羅培南0.011 3 mg·L-1，頭孢曲松鈉0.064 3 mg·L-1，慶大霉素0.550 1 mg·L-1，環丙沙星+美羅培南0.132 4 mg·L-1，頭孢曲松鈉+慶大霉素0.639 2 mg·L-1。

2.4 抗菌藥物不同稀釋濃度對內毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素。實驗驗證結果顯示，當培養時間為4 h，單獨使用抗菌藥物時，細菌釋放內毒素量大小順序為1倍MIC>10倍 MIC>100倍MIC，具體結果如表3所示。

2.5 不同培養時間對內毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，培養時間是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素。實驗驗證結果顯示，當抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度為10倍MIC，單獨使用抗菌藥物時，抗菌藥物作用時間越長，內毒素釋放量越大，見表4。

2.6 不同抗菌藥物使用方法對內毒素釋放量的影響

通過Logistic回歸分析可知，兩種抗菌藥物聯用是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素。實驗驗證結果顯示，當培養時間為4 h，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度為10倍MIC時，單獨使用環丙沙星和美羅培南，比兩者聯合使用釋放的內毒素量多；單獨使用頭孢曲松鈉和慶大霉素，比兩者聯合使用釋放的內毒素量多，見表5。

表2肺炎克雷伯菌釋放內毒素影響因素的Logistic回歸分析

Tab2LogisticregressionanalysisoffactorsaffectingendotoxinreleasefromKlebsiellapneumoniae

相關因素參數估計標準誤χ2值P值OR值95% CI抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度0.475 70.274 24.435 20.030 31.4121.078～2.561培養時間0.452 60.374 85.274 30.025 52.0951.861～2.957兩種抗菌藥物聯用0.487 50.356 54.984 70.047 52.6721.901～3.012

表3不同稀釋濃度對內毒素釋放量的影響EU·ml-1

Tab3EffectofdifferentdilutionconcentrationonreleaseofendotoxinEU·ml-1

表4不同培養時間對內毒素釋放量的影響EU·ml-1

Tab4EffectofdifferentculturetimeonreleaseofendotoxinEU·ml-1

表5不同抗菌藥物使用方法對內毒素釋放量的影響

Tab5Effectsofdifferentantimicrobialagentsonendotoxinrelease

抗菌藥物內毒素釋放量/EU·ml-1t/χ2值P值環丙沙星5 640±284美羅培南9 298±41022.345<0.001環丙沙星+美羅培南1 760±99頭孢曲松鈉7 583±301慶大霉素941±5540.956<0.001頭孢曲松鈉+慶大霉素428±31

3 討 論

肺炎克雷伯菌屬于克雷伯菌屬中的7個亞種之一，為重要的條件型致病菌，正常人的肺炎克雷伯菌帶菌率約為5%，住院患者因抵抗力降低，加之醫院為各種病菌的聚集地，帶菌率約為20%。肺炎克雷伯菌在臨床中常引發肺炎、支氣管炎、外科傷口感染等疾病，嚴重時可導致患者多個內臟器官衰竭，對患者生命安全帶來極大的威脅。且在革蘭陰性菌感染疾病中，約有90%的疾病均為肺炎克雷伯菌導致。因此，對肺炎克雷伯菌的研究已成為當今的熱點。

近年來，由于醫療技術的發展，多種抗菌類藥物已被應用于肺炎克雷伯菌的抑制中，由此引發了肺炎克雷伯菌的耐藥性不斷提高。有研究表明，肺炎克雷伯菌的耐藥性與其自身的主動外排系統、金屬酶等有關，其中聯系最為密切的是超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)。抗生素類藥物使肺炎克雷伯菌耐藥性增強的同時，細胞內毒素的釋放也成為了人們關注的問題，內毒素可引發患者內毒素血癥，增加休克發生率和死亡率。已有研究報道，單用或聯用不同濃度的抗菌類藥物，內毒素的釋放量也會不同。因此，本研究致力于利用Logistic回歸分析探究肺炎患者體內肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，并設計體外實驗對影響因素進行驗證，為合理使用抗菌藥物提供理論依據。

目前常用的細胞內毒素檢測方法包括終點比色法、動態比色法和動態比濁法[13]。有研究表明，動態比濁法相比終點比色法具有更高的靈敏度和更大的測試范圍，相比動態比色法具有更強的抗干擾能力[14]。因此本研究中選取動態比濁法對細胞內毒素進行定量檢測，以提高實驗結果的準確性和可信度。

通過對肺炎患者體內肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素進行Logistic回歸分析可知，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度、培養時間和兩種抗菌藥物聯用是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，是否使用M- H肉湯培養基不對肺炎克雷伯菌釋放內毒素產生影響。當培養時間為4 h，單獨使用抗菌藥物時，細菌釋放內毒素量大小順序為1倍MIC>10倍MIC>100倍MIC，說明低濃度的抗菌藥物能夠對肺炎克雷伯菌產生誘導作用，誘導其釋放更多的細菌內毒素。相關文獻表明，當抗菌藥物作用于細菌時，不僅僅能夠通過殺死細菌細胞，使其細胞壁發生破裂而導致內毒素得到釋放，還有可能是低濃度的抗菌藥物通過其他作用機制，使細菌細胞內的內毒素釋放出來[15]。因此，在臨床治療中確定抗菌藥物濃度時，要根據患者情況給予足夠的抗菌藥物濃度，一方面有助于徹底消滅細菌，控制患者感染情況，另一方面也能避免細菌細胞中內毒素的釋放對患者機體功能產生影響。

當抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度為10倍MIC，單獨使用抗菌藥物時，細菌釋放內毒素量大小順序為8 h>4 h>2 h>1 h。即抗菌藥物作用時間越長，內毒素釋放量越大。有研究表明，當抗菌藥物作用于人體時間過長時，殺死細菌數量加大，因此細菌死后，胞內內毒素釋放量增多[16]。同時，當長時間使用同一種抗菌藥物作用于人體時，可使細菌產生耐藥性，使得抗菌效果大大降低，患者感染癥狀加重。因此，在臨床中對肺炎患者使用抗菌藥物時，應明確抗菌藥物的使用時間，保證抗菌效果的同時，避免患者產生抗菌藥物耐藥性，影響抗菌效果。

當培養時間為4 h、抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度為10倍MIC時，單獨使用環丙沙星和美羅培南，比兩者聯合使用釋放的內毒素量多；單獨使用頭孢曲松鈉和慶大霉素，比兩者聯合使用釋放的內毒素量多。Goscinski等[17]的研究結果表明，不同抗菌藥物殺滅細菌時誘導細菌細胞釋放內毒素數量的差異可能與各抗菌藥物殺菌時的工作機制不同有關。氨基糖苷類抗菌藥物殺滅細菌時僅對細胞內的蛋白質合成產生抑制作用，不對細胞的細胞壁產生破壞，因此殺菌后內毒素釋放量較低。氟喹諾酮類抗菌藥物可以破壞內毒素與外膜磷脂分子之間的聯系，使兩者之間穩定性降低，進而降低細胞內毒素的釋放量[18]。但其抑制內毒素釋放的效果相比氨基糖苷類略差。因此如本研究中結果顯示，不同的抗菌藥物聯用時，抑制細胞內毒素釋放的效果相比單獨使用抗菌藥物大大增強。當美羅培南作用于肺炎克雷伯菌時，細胞內毒素的釋放量顯著高于其他抗菌藥物，達到(9 298±410)EU·ml-1。因為美羅培南屬于β- 內酰胺類抗生素，這種抗菌藥物的作用機制是與青霉素結合蛋白(PBPS)結合，使細菌細胞壁的合成過程受到抑制，故而殺滅細菌。因此，當美羅培南作用于肺炎克雷伯菌時，細菌細胞壁合成受阻，導致細胞內內毒素完全釋放，因此相比其他抗菌藥物內毒素釋放量較高[19]。臨床上常用的β- 內酰胺類抗生素還包括頭孢唑肟、氟氧頭孢鈉等[20]，在臨床使用時應嚴格控制此類抗生素的使用劑量、作用時間，避免增加內毒素的釋放量而引發內毒素血癥，對患者生命健康造成威脅。

綜上所述，抗菌藥物標準菌株液稀釋濃度、培養時間和兩種抗菌藥物聯用是肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，是否使用M- H肉湯培養基不對肺炎克雷伯菌釋放內毒素產生影響。同種抗菌藥物相同時間下細菌釋放內毒素量大小順序為1倍MIC>10倍MIC>100倍MIC，同種抗菌藥物相同濃度下細菌釋放內毒素量大小順序為8 h>4 h>2 h>1 h，相同時間和濃度下單獨使用抗菌藥物比聯合使用細菌釋放內毒素量更多。在臨床上選用肺炎克雷伯菌抗菌藥物時，應結合肺炎克雷伯菌釋放內毒素的影響因素，合理選用抗菌藥物。