血栓素A2及PI3K/AKT信號通路在早發(fā)型子癇前期的作用研究

侯敬，李斯寧，張玉芳，梁爽，張秀榮，張義，朱艷菊

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨科，河北 承德 067000)

子癇前期是妊娠期特有的嚴重威脅孕婦和圍產(chǎn)兒健康狀況，且直接影響妊娠結(jié)局的疾病，其發(fā)病數(shù)占妊娠總數(shù)的5%～10%[1- 2]。子癇前期主要特點為妊娠大于等于20周后出現(xiàn)異常的機體血壓升高、蛋白尿和炎癥因子升高。患有子癇前期的孕婦易發(fā)小血管全身性痙攣、內(nèi)皮細胞的大量損傷和局部的身體缺血，嚴重時可累及機體的多個重要臟器，甚至引發(fā)孕婦和圍產(chǎn)兒的死亡[3- 4]。據(jù)報道，子癇前期的發(fā)病時間越早，圍生兒的病死率則越高。有研究表明，子癇前期孕婦體內(nèi)的胎盤血流灌注不足、炎癥因子及有害物質(zhì)的釋放和氧化應(yīng)激狀態(tài)與胎盤中血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)有關(guān)，TXA2具有強烈收縮血管的功能，并能有效增加血管緊張素Ⅱ的敏感性，進而引發(fā)母體血壓升高和臨床蛋白尿等[5- 6]。TXA2同時也能夠激活磷脂酰肌醇3- 激酶(phosphoinositide 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路，介導(dǎo)機體的炎癥反應(yīng)，調(diào)控細胞的凋亡發(fā)生。本研究通過選取本院2015年5月至2017年5月收治的子癇前期孕婦和正常孕婦的血清和胎盤組織，檢測TXA2的表達，探討PI3K/AKT信號通路在此過程中的重要作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取60例子癇前期單胎孕婦作為觀察組，患者平均年齡(25.67±2.23)歲，發(fā)病孕周(26.41±3.15)周。選取正常孕婦30例為對照組，平均年齡(25.72±2.18)歲，平均孕周(26.33±3.24)周。子癇前期診斷標準依據(jù)參2011年威廉姆斯產(chǎn)科學(xué)(第23版)[7]。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者家屬自愿簽署知情同意書。觀察組和對照組均無其他妊娠內(nèi)外科相關(guān)疾病和并發(fā)癥；患者無冠心病、腦梗死、其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、精神疾病、腫瘤、自身免疫性或遺傳性疾病等。

1.2 血液檢測方法

收集觀察組和對照組孕婦清晨空腹血液6 ml，2 000 r·min-1低溫離心15 mim，常規(guī)分離血清，收集待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清TXA2、PI3K和AKT含量，試劑盒購于美國R&D公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 胎盤取材

觀察組和對照組孕婦自然分娩或手術(shù)分娩后取出娩出胎盤，避開壞死及鈣化區(qū)，在胎盤臍帶附著處取約為1 cm3母體面全層胎盤組織，用PBS反復(fù)進行漂洗后放于甲醛溶液(10%)中固定并進行石蠟包埋。或取出相應(yīng)組織置于液氮中，進行下一步RNA或蛋白提取。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測TXA2蛋白表達水平

取孕婦胎盤石蠟標本用5%血清室溫封閉40 min后，分別加入1∶1 000的TXA2單克隆抗體4 ℃過夜孵育。隔天加入二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，加入SP后恒溫反應(yīng)持續(xù)30 min，加入DAB顯色液進行顯色，中性樹膠封片后用10、40倍物鏡顯微鏡進行觀察。TXA2的陽性表達主要表現(xiàn)為孕婦胎盤組織細胞切片內(nèi)檢測到棕黃色的顆粒。切片隨機選擇6個高倍鏡視野(×400)進行計數(shù)，計算孕婦胎盤組織中TXA2蛋白表達的平均光密度(mean density)。

1.5 Caspase 3活性檢測

取胎盤組織冰上裂解，4 ℃離心后收集胎盤組織的上清液。96孔板中加入緩沖液稀釋好的蛋白樣本50 μl和LEHD- pNA底物5 μl 37 ℃孵育1 h，每個樣本重復(fù)3孔，其吸光值(OD值)在酶標儀405 nm處進行測定。Caspase- 3活性=(各實驗組OD值-調(diào)零組OD值)/標準曲線斜率。

1.6 Western blotting檢測TXA2、PI3K和AKT蛋白表達水平

取胎盤組織冰上裂解2 h，蛋白濃度采用BCA試劑盒進行測定，調(diào)整各組蛋白濃度總量為30 μg·μl-1。將觀察組和對照組孕婦胎盤蛋白樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠中(10% SDS)進行電泳和轉(zhuǎn)膜，加入多克隆抗體TXA2、PI3K、AKT一抗(一抗均以1∶5 000稀釋)和辣根過氧化物酶二抗(以1∶1 000稀釋)。顯色法采用ECL顯色，蛋白表達灰度掃描用Bio- Pro凝膠成像分析儀，Quantity- one軟件進行相應(yīng)蛋白含量的測定。

1.7 Real- time PCR檢測TXA2、PI3K和AKT mRNA表達量

采用Real- time熒光定量PCR法測定TXA2、PI3K和AKT mRNA表達量。胎盤組織RNA用Trizol法提取，用含有GDNA Eraser的試劑盒進行cDNA的合成和逆轉(zhuǎn)錄，嚴格按照說明書進行熒光定量分析，采用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進行Real- time PCR實驗操作。采用相對定量閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold, CT)值法計算不同樣本的相對表達量。公式:ΔΔCT=(CT實驗組的基因-CT實驗組管家基因)-(CT對照組目的基因-CT對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血液指標檢測結(jié)果

與對照組相比，觀察組患者血清TXA2、PI3K、AKT含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

與對照組比較，aP<0.05

2.2 Caspase 3活性檢測結(jié)果

與對照組相比，觀察組患者胎盤組織內(nèi)Caspase 3活性明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.3 TXA2、PI3K和AKT蛋白表達水平

與對照組相比，觀察組患者血清TXA2、PI3K和AKT蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4 TXA2、PI3K和AKT mRNA表達水平

與對照組相比，觀察組患者血清TXA2、PI3K和AKT mRNA表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

與對照組相比，aP<0.05

圖1Caspase3活性檢測結(jié)果

與對照組相比，aP<0.05

圖2TXA2、PI3K和AKT蛋白表達含量

2.5 TXA2免疫組化結(jié)果

與對照組TXA2蛋白平均光密度(1.34±0.42)相比，觀察組患者胎盤組織內(nèi)TXA2蛋白平均光密度水平(1.86±0.39)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

子癇前期是嚴重威脅孕婦和圍產(chǎn)兒健康的常見孕期并發(fā)癥。目前認為子宮內(nèi)滋養(yǎng)細胞侵襲異常和子宮螺旋動脈重鑄不足是子癇前期發(fā)病的第一階段，此過程可以直接導(dǎo)致孕婦子癇前期發(fā)病第二階段的胎盤血流灌注不足和機體缺血缺氧的氧化應(yīng)激狀態(tài)[8- 9]。早發(fā)型子癇前期起病早、收縮壓及舒張壓同時升高，隨著疾病進展，常常表現(xiàn)為嚴重的高血壓(≥160/110 mmHg)，且血壓增高幅度較大。同時，病理性的胎盤可以釋放炎癥介質(zhì)和毒性因子，并通過血液循環(huán)進入母體和胎兒體內(nèi)，損傷大量的孕婦血管內(nèi)皮細胞，并伴隨全身性的炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致母體臨床高血壓和蛋白尿等癥狀和體征。早發(fā)型子癇前期孕婦常伴有頭痛、視覺障礙、踺反射亢進、血小板減少、肝腎功能異常、胎盤早剝、HELLP綜合征、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎死宮內(nèi)等嚴重并發(fā)癥。研究表明，子癇前期患者內(nèi)皮細胞受損、凝血功能異常是引起胎兒生長發(fā)育遲緩，造成孕婦不良妊娠結(jié)局的重要原因。妊娠中晚期時，孕婦血中的雌激素水平顯著升高，機體內(nèi)血小板和凝血因子的數(shù)量增加，血小板的大量聚集使血管的黏附性增強，抑制體內(nèi)抗凝血酶的作用，血液處于高凝狀態(tài)。

與對照組相比，aP<0.05

圖3TXA2、PI3K和AKTmRNA表達含量

血栓素合酶(thromboxane synthase, TXS)是血小板中發(fā)現(xiàn)的微粒體酶，在肺臟、腎臟、胃、脾和結(jié)腸等組織內(nèi)廣泛表達[10- 11]。當機體發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)時，TXS可催化TXA2激活，參與機體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。TXA2具有強烈的血管收縮功能，并能使血管緊張素Ⅱ的敏感性增強，進而引發(fā)母體血壓升高和臨床蛋白尿等。TXA2可通過活化特定G- 蛋白偶聯(lián)血栓素受體(thromboxane receptor, TPr)調(diào)節(jié)信號級聯(lián)反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)機體內(nèi)的細胞黏附情況、細胞運動情況、細胞增殖存活情況和細胞凋亡情況等[12- 13]。TXA2同時也能夠激活PI3K/AKT信號通路，介導(dǎo)機體的炎癥反應(yīng)、調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生，參與調(diào)節(jié)機體的病理生理狀態(tài)。PI3K/AKT作為一種磷脂酰肌醇激酶級聯(lián)通路，參與調(diào)節(jié)細胞生長、細胞骨架重塑和細胞凋亡等[14]。PI3K激活后可通過脂質(zhì)底物磷酸化活化下游AKT，并對其下游靶蛋白mTOR、NF- κB和Caspase 3等進行磷酸化的激活或抑制，介導(dǎo)胰島素、多種生長因子等誘發(fā)細胞生長，調(diào)節(jié)細胞凋亡與代謝過程[14- 15]。

本實驗通過檢測觀察組和對照組的孕婦血清細胞因子含量發(fā)現(xiàn)，觀察組患者血清TXA2、PI3K、AKT含量明顯升高，說明子癇前期孕婦體內(nèi)TXA2顯著表達，與PI3K和AKT共同參與子癇前期的生理過程。免疫組化結(jié)果顯示，早發(fā)型子癇前期孕婦胎盤內(nèi)TXA2表達顯著增加，明顯高于正常孕婦胎盤內(nèi)TXA2的含量，TXA2在早發(fā)型子癇前期孕婦體內(nèi)起到重要的作用，參與調(diào)節(jié)下游的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生理病理過程。與對照組相比，觀察組患者胎盤組織內(nèi)TXA2、PI3K及AKT蛋白和mRNA表達水平明顯升高，Caspase 3活性顯著升高，說明與正常妊娠孕婦相比，子癇前期孕婦體內(nèi)和胎盤內(nèi)TXA2被大量釋放入血，PI3K/AKT信號通路被激活，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡蛋白的表達，進而在早發(fā)型子癇前期患者體內(nèi)起到重要的調(diào)控作用。

綜上所述，TXA2可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路參與調(diào)控早發(fā)型子癇前期患者體內(nèi)的病理生理過程，對于治療和控制早發(fā)型子癇前期、減少孕婦和胎兒的病死率具有重要的臨床意義。