改良鎮靜技術促進雞胚荷瘤模型的磁共振成像研究

2018-11-02 12:21:14左智左鵬飛王鑫史秋寅丁建東左揚松馬根山

東南大學學報(醫學版) 2018年5期

左智，左鵬飛，王鑫，史秋寅，丁建東，左揚松，馬根山

(1.東南大學附屬中大醫院心血管內科，江蘇南京 210009；2.漣水縣人民醫院呼吸內科，江蘇漣水 223400)

雞胚模型已被廣泛應用于多種研究領域[1- 12]，但其影像學研究卻困難重重[13- 19]。究其原因主要在于雞胚的“胎動”。在雞蛋中雞胚漂浮在尿囊液中，無法對其進行物理固定；多種麻醉藥物也被證實效果甚微，甚至可能產生毒副作用、降低存活率[13]。磁共振掃描通常需要一定的時間，在雞胚移動的情況下會出現運動偽影，圖像質量大打折扣。有些研究者將雞胚處死后再進行掃描[11,17,20- 24]，雖然消除了偽影，但重復觀察失去可能，研究深度和意義都受到極大的限制。

低溫冷卻對雞胚具有鎮靜效果，Bain等[16]在4 ℃冰箱內冷卻雞胚1 h，可以實現一定程度的鎮靜。但隨著雞胚發育，其對1 h的冷卻耐受逐漸增強，孵育10 d后需要更長時間來保證鎮靜效果[25]。我們設計了在4 ℃ 環境下依據雞胚孵育日齡制定個體化的冷卻時間，保證足夠長時間的鎮靜效果。本研究在使用改良鎮靜技術后，對雞胚荷瘤模型進行充分的影像學觀察，大大擴展了該模型在腫瘤研究領域的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

受精的雞蛋購于本地農場，經清潔后置于孵化箱中，孵化環境設置為溫度37.8 ℃、濕度60%。孵化4 d后在雞蛋氣室端開窗，注意不要損傷尿囊膜。開窗后檢查雞胚是否發育正常，移除未受精的、死亡的雞蛋。選取尿囊膜血管網豐富的雞蛋，在尿囊膜正中間移植腫瘤細胞，移植后用醫用膠布封閉雞蛋的開口，妥善放置回孵化箱中。

1.2 方法

1.2.1 改良冷卻鎮靜技術用29只雞胚改良冷卻鎮靜技術，隨機分為3組：A組(n=10)作為對照持續孵化，不予人為干預；B組(n=10)每天在4 ℃冰箱冷卻1 h；C組(n=9)用于確定每日齡雞胚最佳的冷卻時間。C組再隨機分為C1、C2、C3 3個亞組，每個亞組3個雞胚。隨著雞胚孵化日齡的增加，對冷卻時長的需求也增加。C1組使用與前一日相同的冷卻時長，C2組多冷卻10 min，而C3組在此基礎上再多冷卻10 min，冷卻后立即使用磁共振掃描確定是否達到鎮靜。取3個亞組磁共振成像(MRI)沒有偽影的最短冷卻時長作為該日齡的最佳時長。

1.2.2 移植腫瘤細胞本研究使用人乳腺癌細胞MDA- MB- 231細胞系，在含10%FBS的L- 15培養基中培養。在雞胚孵化第7天，在尿囊膜上放置直徑為6 mm 的橡膠圈，2×106個腫瘤細胞混合在20 μl濃度為50%的Matrigel基質膠中，種植于橡膠圈范圍內(圖1)。

腫瘤細胞移植96 h后形成了肉眼可見的實體腫瘤黑箭頭：實體移植瘤；白箭頭：用來限制腫瘤生長范圍的橡膠圈

圖1雞胚荷瘤模型實物圖像

1.2.3 磁共振掃描使用Bruker高場11.7T動物磁共振系統、60 mm正交線圈完成掃描。從腫瘤細胞移植后的第4天到第9天，每天使用快速自旋回波(rapid aquicision with relaxation enhancement, RARE)序列掃描獲得T2加權圖像，具體參數如下：重復時間(TR)/回波時間(TE)4 320/45 ms, 矩陣數目650×650,分辨率77 μm×91 μm,層厚0.5 mm,層間距為零,RARE值8,激勵次數4。

1.2.4 定量分析腫瘤體積、評估腫瘤重量、病理組織學分析在每一個MRI圖像層面上使用Segment軟件描記腫瘤輪廓，計算切面面積，所有層面面積總和乘以層厚估算出腫瘤體積。作時間-體積點線圖評估腫瘤的增殖趨勢。在最后1天所有掃描完成后處死雞胚，切下實體腫瘤，稱重并用福爾馬林保存。將腫瘤標本冷凍切片并染色，與所獲得的MRI圖像對比，評價充分鎮靜后的MRI的質量與可靠程度。

1.3 統計學處理

使用SPSS軟件進行數據分析，Speramanrho測試、Mahn- Whitney U測試用于評估磁共振估算的腫瘤體積和腫瘤重量的關聯程度，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 改良鎮靜技術

通過實驗我們發現，對于孵化日齡大于10 d的雞胚，1 h的常規冷卻已經達不到預期的鎮靜效果，運動偽影嚴重影響了MRI。經過C組每一天的比較，我們總結出1份改良鎮靜時間表，詳見表1。使用改良鎮靜技術可以保證孵化6～18 d的雞胚充分鎮靜，而且并不會提高雞胚的死亡率，非常安全。

表1改良冷卻鎮靜技術

孵化日齡冷卻時長(達到鎮靜的最短時間)/minA組(n=10)B組(n=10)C組(n=9)6060607060608060609060601006070110607012060701306090140609015060110160601101706012018060120存活率0.8(8/10)0.9(9/10)0.89(8/9)

2.2 高分辨率MRI

改良后延長的鎮靜時間允許我們使用分辨率更高、耗時更長的磁共振序列，獲得的圖像像素可以精確到77 μm×91 μm。圖像精度、清晰度大大提高，可以觀察非常小的解剖結構。我們可以清楚地看到每一天雞胚大腦、心臟、眼、肝臟、肌胃、膝關節、肺、小腸、喙以及脊椎的生長(圖2)，這在以往是非常不可思議的。

1.腦；2.心臟；3.眼；4.肝臟；5.胃(俗稱雞胗)；6.膝關節；7.肺；8.小腸；9.雞喙；10.脊椎

圖2雞胚生長過程的磁共振圖像

2.3 腫瘤增殖的MRI分析

15只荷瘤雞胚用于觀察腫瘤增殖，其中2只雞胚死亡，4只腫瘤細胞沒有成功移植，剩下的9只完成了每日1次的磁共振掃描。MRI下清晰地觀察到腫瘤每日的增殖過程(圖3)。每一天每只荷瘤雞胚都獲得了相當高質量的MRI圖像。通過分析我們發現，雖然9只雞蛋都被移植了2×106個腫瘤細胞，但腫瘤的增殖速度、最終長成的實體瘤的體積大小卻不盡相同(圖4)。在腫瘤細胞移植后的第9天，腫瘤的體積懸殊，4～37.5 mm3。去除了結締組織、血管后，最終實體瘤的體積為0.77～18.77 mm3。尿囊膜移植瘤的具體結構見圖5，包括實體瘤部分、血管以及一些疏松結締組織。研究中并沒有觀察到腫瘤的生長對于雞胚發育的異常影響。

在腫瘤被移除后對其稱重，9個腫瘤的重量見表2。對于磁共振測量的體積以及實際腫瘤的稱重進行回歸分析，二者存在顯著的線性關系，R2=0.9，P<0.01。平均重量/體積的值等于0.78 mg·mm-3，與已知數據1 mg·mm-3相比差異無統計學意義(P>0.65)。

2.4 病理結果

腫瘤的病理結果見圖6，可以發現移植瘤的結構分為數個部分，和尿囊膜直接接觸的部分細胞密度最高，而離尿囊膜稍遠的腫瘤中心部分細胞密度較低，血管新生程度也較低。

3 討論

觀察腫瘤增殖對于研發抗腫瘤藥物非常重要。目前裸鼠是荷瘤動物的金標準，但其成本高，且動物倫理的審核越來越嚴格。在實驗動物福利和保護的大前提下，裸鼠研究將需要越來越大的經濟和時間成本。雞胚作為活體模型早已得到廣泛使用，由于尚未發育完善的免疫系統、血供豐富可直視的尿囊膜結構，具有作為荷瘤載體的重大價值和潛力[4]。使用雞胚荷瘤模型進行短期預實驗，可以降低實驗成本，減少裸鼠使用數量，提高實驗效率。

在腫瘤研究中影像學數據必不可少，無創的磁共振掃描能在不干預實驗樣本的情況下提供相當多的信息。截至目前，活體雞胚MRI的最小像素為200 μm×200 μm[13- 16,18,24- 26]。雞胚的不穩定限制了單次掃描的時長，但是圖像分辨率越高，花費的掃描時間越長。而移植瘤由于只有數天的增殖時間，體積不會太大，內在結構更加微小，且往往形狀不規則。因此若想使用磁共振來分析這些腫瘤，高分辨率的必要性不言而喻。本研究改良了Bain團隊的冷卻鎮靜技術[16,26]，按照日齡的增加確定了每天最優的冷卻時間，在保證安全的前提下提高了鎮靜效率，將成像像素進一步縮小到77 μm×91 μm。

粉色圓圈內為逐漸長大的實體瘤

圖3移植瘤成像及腫瘤增殖觀察

與免疫組化結果的對比證明了改良后磁共振評估的可靠性與精確程度。由于遠離血供，腫瘤核心部分細胞密度較低、新生血管欠活躍，磁共振圖像中觀察到明顯減低的信號密度；實體腫瘤的外周部分在磁共振圖像中呈現較高的信號，這與組織學證明的豐富的血管系統、密集的腫瘤細胞與活躍的增殖遷移結果一致。本研究成功地使用了磁共振觀察雞胚荷瘤的發展過程，這都得益于改良鎮靜技術，使雞胚荷瘤模型的應用價值大大提高。