鹽酸納洛酮對急性呼吸窘迫綜合征大鼠β- 內啡肽及T淋巴細胞亞群的影響

馮敏，劉剛，徐大千

(鄭州大學第一附屬醫院 重癥醫學科，河南 鄭州 450052)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是臨床常見的急危重癥，在感染、創傷、休克等因素影響下，出現頑固性低血氧癥、肺水腫和進行性呼吸困難等癥狀，其病死率高達50%[1- 2]。目前ARDS發病機制尚不明確，相關報道顯示與β- 內啡肽(β- Endorphins，β- EP)水平，腫瘤壞死因子- α(tumour necrosis factor- α,TNF- α)、白介素- 1β(interleukin- β,IL- 1β)、IL- 6、IL- 8參與的炎癥反應等密切相關[3- 5]。鹽酸納洛酮是阿片受體拮抗劑，通過與阿片受體特異性結合，抑制機體全身炎癥反應，降低炎癥因子，維持細胞膜的通透性，減少細胞損傷[6- 7]。研究發現鹽酸納洛酮對呼吸衰竭有保護作用，可減輕ARDS引起的肺間質、肺泡水腫，肺組織壞死等癥狀[8- 9]。本研究通過觀察鹽酸納洛酮對ARDS大鼠β- 內啡肽、T淋巴細胞亞群和細胞炎癥因子的影響，探討鹽酸納洛酮對ARDS的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康4周齡雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，購自河南省動物實驗中心，于實驗室室溫(25±2)℃、濕度40%～60%下適應性飼養1周，自由進食和飲水。

1.1.2 儀器與試劑 -80 ℃冰箱(北京德馨永嘉科技有限公司)，高速冷凍離心機(上海析域儀器設備有限公司)，流式細胞儀(上海澤泉科技股份有限公司)，振蕩器(常州恒隆儀器有限公司)，油酸(湖南長沙恒昌化工有限公司)，烏拉坦(上海浩然生物技術有限公司)，鹽酸納洛酮注射液(北京四環制藥有限公司)，蘇木精- 伊紅(北京索萊寶科技有限公司)，大鼠β- EP酶聯免疫吸附試驗(enzyme- linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(美國R&D公司)，TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8 ELISA試劑盒(美國TPI公司)。乙醇、甲醛為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 分組給藥及ARDS模型的建立 30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、納洛酮組，每組10只。各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦1.0 g·kg-1麻醉，分離左側股靜脈，進行股靜脈插管。對照組大鼠注射生理鹽水1.15 ml·kg-1；模型組、納洛酮組大鼠注射油酸0.15 ml·kg-12 h后，模型組大鼠注射生理鹽水1.0 ml·kg-1，納洛酮組大鼠注射1.0 ml·kg-1鹽酸納洛酮。模型組注射油酸6 h內呼吸頻次增加，動脈血氧分壓與吸入氧濃度比值<200 mmHg，表明造模成功，各組大鼠于造模6 h后測定指標。

1.2.2 肺組織濕干比重測定 給藥6 h后腹主動脈取血，加入適量肝素抗凝血，3 000 r·min-1離心分離血漿，置于-80 ℃凍存。頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠左肺，濾紙吸干表面附著水分，稱濕重，于70 ℃下干燥處理48 h至恒重，稱干重，計算左肺組織濕干比重(lung wet/dry weight, W/D)。

1.2.3 病理標本制作 取各組大鼠右肺下葉，加入10%的甲醛溶液固定24 h，加入乙醇梯度脫水，石蠟包埋、切片，采用蘇木精- 伊紅染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織結構損傷情況、肺不張程度、透明膜形成情況、肺泡壁增厚程度和炎癥細胞浸潤程度等病理學變化情況。

1.2.4 血漿β- 內啡肽檢測 取大鼠血漿，使用ELISA試劑盒檢測β- EP，實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

1.2.5 外周血T淋巴細胞亞群 取大鼠血漿100 μl于兩個流式測定管中(標記為同型管與抗體管)，同型管加入16 μl CD3+、CD4+、CD8+混合同型，抗體管中加入16 μl CD3+、CD4+、CD8+混合抗體(APC標記CD3+、PE標記CD4+、FITC標記CD8+)，于振蕩器混合均勻，室溫條件下避光孵育30 min，加入2 ml PBS溶液，混合均勻，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入0.5 ml PBS溶液，混合均勻，置于流式細胞儀檢測。

1.2.6 肺勻漿TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8的檢測 取右肺中葉1 g，加入0.9%氯化鈉溶液9 ml，冰浴條件下勻漿，于4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，置于-80 ℃凍存。采用ELISA法分別測定TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8的含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺組織濕干比重測定結果

與對照組相比，模型組大鼠肺組織濕干比重顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，納洛酮組大鼠肺組織濕干比重顯著下降(P<0.05)，見表1。

組 別nW/D對照組103.48±0.24模型組108.86±0.35a納洛酮組103.52±0.33bF值9.943P值<0.05

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.2 血漿β- EP測定結果

與對照組相比，模型組大鼠β- EP水平顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，納洛酮組大鼠β- EP水平顯著下降(P<0.05)，見表2。

組 別nβ-EP/pg·ml-1對照組1033.51±3.64模型組1059.24±4.48a納洛酮組1041.54±2.54bF值12.250P值<0.05

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 外周血T淋巴細胞亞群測定結果

與對照組相比，模型組大鼠CD3+、CD4+T細胞含量和CD4+/CD8+T細胞值顯著上升，CD8+T細胞含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，納洛酮組大鼠CD3+、CD4+T細胞含量和CD4+/CD8+T細胞值顯著下降，CD8+T細胞含量顯著上升(P<0.05)。見表3。

2.4 TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8測定結果

與對照組相比，模型組大鼠肺勻漿中TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，納洛酮組大鼠肺勻漿中TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8水平均顯著降低(P<0.05)，見表4。

2.5 病理學檢測結果

對照組大鼠肺組織無損傷，肺泡腔、肺泡無出血現象。模型組大鼠的肺組織結構明顯損傷、肺泡腔萎陷、出血，肺泡壁明顯增厚，有大量紅細胞滲出，與對照組比較，嗜中性粒細胞聚集，數量顯著增加(P<0.05)；納洛酮組大鼠肺組織結構損傷程度相對模型組減輕，出血情況有所減輕，肺泡壁間隔減小，嗜中性粒細胞聚集受到抑制，與模型組比較，數量顯著降低(P<0.05)。見圖1、表5。

組 別nCD3+/%CD4+/%CD8+/%CD4+/ CD8+對照組1052.31±7.1335.68±5.6415.25±3.942.15±0.11模型組1072.15±9.94a42.62±3.95a11.74±3.24a3.16±0.08a納洛酮組1050.20±7.48b33.54±4.34b16.65±4.87b1.98±0.09bF值20.17216.85124.50314.100P值<0.05<0.05<0.05<0.05

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

組 別nTNF-α/pg·m-1IL- 1β/pg·m-1IL-6/pg·m-1IL-8/pg·m-1對照組1063.26±5.8437.36±7.6538.45±5.9532.59±5.85模型組10104.75±8.74a54.74±5.38a52.77±4.68a46.75±3.48a納洛酮組1078.36±7.41b41.83±5.73b43.14±6.64b36.48±4.78bF值20.04617.88127.10419.881P值<0.05<0.05<0.05<0.05

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖1各組大鼠病理組織HE染色結果(×400)

Fig1ResultsofpathologicaltissueHEstainingineachgroup(×400)

組 別n嗜中性粒細胞計數/×105 L-1對照組100.93±0.13模型組102.54±0.27a納洛酮組101.46±0.22bF值7.419P值<0.05

與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討 論

目前臨床上對ARDS的發病機制尚未明確，普遍認為ARDS的發生主要由于致病因子激活了細胞和體液免疫，誘導炎癥介質釋放, 使體內促/抗炎細胞因子嚴重失衡[10]。β- EP是內源性阿片肽，是體內重要的免疫調節因子，主要協調和維持應激時機體各個系統的功能正常[11]。鹽酸納洛酮作為阿片受體拮抗劑，可通過與阿片受體特異性結合，對ARDS引起的免疫功能紊亂起保護作用[12]。T淋巴細胞作為免疫效應細胞，在細胞免疫反應中發揮主導作用，主要包括CD3+、CD4+、CD8+亞群，CD3+T細胞起免疫促進的作用，CD4+T細胞在機體免疫中起輔助作用，CD8+T細胞具有免疫抑制作用[13]。CD8+T細胞含量上升會抑制機體免疫功能、抑制CD4+T細胞的免疫促進能力，CD4+與CD8+T細胞的比值能表明T淋巴細胞亞群平衡狀態，反映機體免疫能力。細胞炎癥因子TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8整體水平變化，導致肺內皮、上皮屏障損傷是ARDS的特征[14- 15]。TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8水平可反映機體的免疫情況，因此可作為反映肺損傷嚴重程度的指標。本研究結果顯示，模型組大鼠血漿中β- EP含量與對照組相比顯著升高，納洛酮組大鼠血漿β- EP含量與模型組比較顯著降低，表明鹽酸納洛酮可降低ARDS大鼠血漿β- EP含量，初步推斷鹽酸納洛酮競爭性阻斷β- EP與阿片受體的結合，拮抗β- EP含量升高而引起的免疫抑制，拮抗呼吸抑制，對呼吸衰竭起保護作用。與對照組比較，模型組大鼠CD3+、CD4+T細胞含量和CD4+/CD8+T細胞值顯著上升，CD8+T細胞含量顯著下降。表明ARDS大鼠機體免疫功能過度刺激，免疫抑制細胞的含量減少，機體免疫平衡被打破，導致機體免疫功能失調，鹽酸納洛酮對調節T淋巴細胞平衡具有一定保護作用。此外，β- EP水平變化與CD3+、CD4+T細胞亞群的數目變化呈正相關，可能與T淋巴細胞表面分布著β- EP相應受體有關[16]。模型組大鼠肺勻漿中TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8水顯著高于對照組大鼠，納洛酮組大鼠肺勻漿中TNF- α、IL- 1β、IL- 6、IL- 8水平與模型組比較顯著降低，說明鹽酸納洛酮可有效抑制其水平上升，并降低其含量，對ARDS大鼠肺起保護作用。綜上，ARDS的發生導致機體β- EP水平上升，使神經-免疫系統的信息傳導作用增強，并通過相應受體影響T淋巴細胞亞群從而過度刺激機體的免疫功能。鹽酸納洛酮通過降低β- EP水平，恢復神經-免疫系統的信息傳導作用，調節T淋巴細胞亞群平衡，抑制炎癥因子的釋放，恢復機體免疫功能，對ARDS起保護作用。