MicroRNA- 485- 5p抑制人結直腸癌細胞增殖和侵襲作用的研究

胡秀秀，潘玉琴，王書奎

[1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.南京醫科大學附屬南京醫院(南京市第一醫院)中心實驗室，江蘇 南京 210012]

結直腸癌是發生于結腸或直腸中的常見消化道腫瘤之一。近年來受到人口老齡化和環境污染等影響，結直腸癌發病率和死亡率居高不下[1]，已經成為國內外醫學領域的研究重點。microRNAs(miRNAs)是一種進化上保守的內源性非編碼RNA，通過轉錄后調控靶基因的表達，在生長發育、細胞增殖分化、腫瘤發生發展等一系列病理生理過程中發揮著重要作用[2]。miRNA- 485- 5p在多種腫瘤如口腔鱗狀細胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被報道為抑癌基因。但miR- 485- 5p在結直腸癌中的功能尚未見報道。因此，本研究旨在探討miR- 485- 5p對結直腸癌細胞的增殖、侵襲等表型的影響及其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 質粒的構建

miR- 485- 5p潛在靶基因CD147的3′端非編碼區(3- untranslated region，3′UTR)野生型(WT，包括預測的miR- 485- 5p靶位點)和突變型(Mut，miR- 485- 5p結合位點的8個核苷酸被替換)質粒由蘇州泓迅生物科技股份有限公司構建，其序列經DNA測序證實無誤。

1.2 細胞培養及轉染

293細胞、正常腸黏膜細胞(FHC)和2種人的結直腸癌細胞(HCT8和HCT116)均購自中國科學院上海細胞生物研究所。4種細胞在含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone，美國)的高糖型DMEM培養基(Hyclone，美國)中常規培養。miR- 485- 5p模擬物(miR- 485- 5p mimic)及其相應的陰性對照(miR- NC)由廣州銳博公司合成。當細胞融合度達到30%～50%時使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，美國)進行轉染。轉染步驟參照說明書。

1.3 總RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT- PCR)

采用TRIzol法(Invitrogen，美國)提取總RNA，采用上海吉瑪公司的染料法Hairpin- it miRNAs qRT- PCR定量試劑盒檢測miR- 485- 5p，引物亦由上海吉瑪公司合成,U6作為內源性對照。用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa，中國)進行RNA逆轉錄后，SYBR4?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，中國)檢測CD147 mRNA的表達，β- 肌動蛋白(β- actin)作為內參。待測基因引物設計：CD147上游引物為5′- CCATGCTGGTCTGCAAGTCAG- 3′，下游引物為5′- CCGTTCATGAGGGCCTTGTC- 3′；β- actin上游引物為5′- CTGGAACGGTGAAGGTGACA- 3′，下游引物為5′- AAGGGACTTCCTGTAACAACGCA- 3′。所有反應均在Applied Biosystems 7500型定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上進行。通過2-ΔΔCt方法分析CD147和miR- 485- 5p的相對表達水平。

1.4 CCK- 8法檢測細胞增殖能力

使用CCK- 8溶液(凱基，中國)檢測轉染miR- 485- 5p mimic或miR- NC 24、48、72和96 h的HCT8和HCT116細胞的存活率。每個時間點設6個復孔，實驗重復3次。

1.5 Transwell法檢測細胞侵襲能力

在Transwell小室中測定已轉染miR- 485- 5p mimic或miR- NC的結直腸癌細胞的侵襲能力。實驗步驟如文獻[3]描述。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達

實驗步驟如文獻[4]描述，抗體如下：CD147(目錄號Ab108317，Abcam，1∶5 000)、GAPDH(目錄號ab181602，Abcam，1∶10 000)及山羊抗兔IgG- HRP(目錄號Ab6721，Abcam，1∶10 000)。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測靶基因

使用Lipofectamine 3000將miR- 485- 5p mimic或miR- NC與合成的雙熒光素酶報告基因CD147- 3′UTR- WT或CD147- 3′UTR- Mut共轉染293細胞，隨后用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天，中國)在發光檢測儀(GloMax- 20/20 Luminometer，Promega，美國)中檢測轉染48 h后的熒光素酶活性。

1.8 統計學處理

使用IBM SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。數據以均數±標準差表示，兩組數據的比較采用t檢驗，多組數據的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR- 485- 5p在人結直腸癌細胞中的表達

熒光定量PCR結果顯示,miR- 485- 5p在人結直腸癌細胞株HCT8和HCT116中的表達水平較FHC細胞顯著降低(P<0.05，圖1)。

與FHC細胞比較，aP<0.05

圖1各組細胞中miR-485-5p的表達情況

Fig1ExpressionofmiR-485-5pinvariousgroupsofcells

2.2 miR- 485- 5p mimic在HCT116和HCT8細胞中的轉染效率

為了研究miR- 485- 5p對結直腸癌細胞生物學功能的影響，HCT116和HCT8細胞分別轉染miR- 485- 5p mimic或miR- NC，采用qRT- PCR檢測轉染效率。實驗結果表明,HCT116和HCT8轉染miR- 485- 5p mimic后，miR- 485- 5p的表達分別增高332倍和309倍(圖2)。因此可以看出，miR- 485- 5p mimic及陰性對照轉染良好，轉染方案能夠有效地提高結直腸癌細胞中miR- 485- 5p的表達，有利于后續的細胞功能學和靶基因的實驗研究。

U6為內對照，aP<0.001

圖2qRT-PCR檢測miR-485-5pmimic及miR-NC在人結直腸癌細胞中的轉染效率

Fig2DetectionofmiR-485-5pmimicandmiR-NCtransfectionefficiencyinhumancolorectalcancercellsbyqRT-PCR

2.3 miR- 485- 5p過表達對人結直腸癌細胞增殖能力的影響

與miR- NC組相比，過表達miR- 485- 5p在48 h后能夠顯著抑制HCT116細胞的增殖能力，在72 h后能夠顯著抑制HCT8細胞的增殖能力(圖3)。提示miR- 485- 5p過表達能夠抑制人結直腸癌細胞的增殖。

與miR- NC組比較，aP<0.05

圖3CCK-8實驗檢測轉染人結直腸癌細胞的增殖能力

Fig3CCK-8assayforproliferationoftransfectedhumancolorectalcancercells

2.4 miR- 485- 5p過表達對人結直腸癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗結果顯示，miR- 485- 5p過表達組細胞的侵襲數目顯著低于miR- NC組(圖4)，提示miR- 485- 5p過表達能夠抑制人結直腸癌細胞的體外侵襲能力。

與miR- NC組比較，aP<0.01

圖4Transwell實驗檢測轉染人結直腸癌細胞的侵襲能力(×200)

Fig4Transwellassayfortheinvasionoftransfectedhumancolorectalcancercells(×200)

2.5 miR- 485- 5p靶基因預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證

miRNA靶基因預測軟件microRNA.org (http://www.microrna.org/)和miRDB(http://mirdb.org/)提示CD147可能為miR- 485- 5p調控的靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，CD147- 3′UTR- WT和miR- 485- 5p mimic共轉染后熒光素酶水平明顯下降，CD147- 3′UTR- Mut和miR- 485- 5p mimic共轉染后則沒有明顯的下降(P>0.05，圖5)，提示miR- 485- 5p對CD147可能有直接的調控作用。

與miR- NC+WT組比較，aP<0.01

圖5雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶基因

Fig5Dualluciferasereporterassaysverifytargetgenes

2.6 miR- 485- 5p過表達對人結直腸癌細胞中CD147表達的影響

qRT- PCR及Western blotting結果顯示，miR- 485- 5p過表達組細胞中CD147 mRNA和蛋白表達均顯著低于miR- NC組(圖6)。結果提示miR- 485- 5p過表達能夠抑制人結直腸癌細胞中CD147的表達。

與miR- NC組比較，aP<0.01

圖6qRT-PCR及Westernblotting檢測轉染后人結直腸癌細胞CD147表達

Fig6DetectionofCD147expressioninhumancolorectalcancercellsaftertransfectionbyqRT-PCRandWesternblotting

3 討 論

越來越多的證據表明，miRNA作為抑癌基因或者促癌基因，在結直腸癌的基因調控機制中扮演著重要角色。因此，研究結直腸癌相關miRNA將加深對結直腸癌發生發展分子機制的認識，為這種致命癌癥的有效治療提供新的視角。

研究表明，miR- 485- 5p在多種腫瘤中低表達并可抑制腫瘤的發生和發展。Guo等[5]報道miR- 485- 5p發揮了抑癌作用，其可能調控肝癌細胞的增殖和侵襲，同時也證實斯鈣素2(stanniocalcin 2，STC2)是miR- 485- 5p的直接靶點。與這些報道一致，我們發現2種結直腸癌細胞系中miR- 485- 5p的表達水平比正常腸黏膜細胞低，提示miR- 485- 5p的低表達可能與結直腸癌的進展有關;在功能實驗上，上調miR- 485- 5p的表達可以明顯抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲。miRNA靶基因預測軟件提示CD147可能是miR- 485- 5p的潛在下游靶標。CD147是廣泛表達于多種細胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白，在人體內多種組織細胞如粒細胞、骨髓造血細胞、內皮細胞、活化的T細胞、分化的巨噬細胞等都檢測到CD147的表達[6- 8]。其可以與不同的蛋白偶聯，參與調節機體多種生理過程。研究發現CD147不僅在體內正常的組織細胞中有表達，其在多種腫瘤細胞中也被檢測到且通常表達量增高，主要包括結直腸癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤等[9- 13]。研究表明，CD147與腫瘤的侵襲、轉移、血管形成、化學耐藥等方面都相關[14- 15]。CD147可誘導細胞產生能夠降解細胞外基質或基底膜的多種基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移[16]；CD147可以與單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)結合，促進MCTs對細胞內無氧糖酵解過程中產生的乳酸的轉運，流向腫瘤細胞的乳酸使腫瘤細胞生長的微環境酸化，進而促進腫瘤細胞的侵襲與轉移等[17]；CD147還能夠誘導血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達，參與腫瘤血管的形成過程[18]。因此，CD147在腫瘤的發生和發展過程中發揮著重要的作用。在本研究中，雙熒光素酶報告基因檢測證實miR- 485- 5p可與CD147的3′UTR部分結合。在通過轉染miR- 485- 5p mimic，上調其在結直腸癌細胞中的表達后，qRT- PCR和Western boltting均檢測到CD147下調。這些發現表明CD147和miR- 485- 5p之間呈顯著負相關。因此，我們認為miR- 485- 5p可能直接靶向調節CD147，抑制結直腸癌的生長和侵襲。但是CD147不是唯一可以被miR- 485- 5p靶向調節的。眾所周知，單個miRNA可能調控大量的mRNA，而單個mRNA也可以被多個miRNA調控。miR- 485- 5p及其靶基因CD147只是復雜調控網絡中的一個因素。探索miR- 485- 5p調控的其他基因或調節CD147的其他miRNA是必不可少的，這將能夠更深入地了解結直腸癌發病的分子機制。

本研究揭示了miR- 485- 5p的異常表達與結直腸癌生理病理過程之間的潛在關系。miR- 485- 5p在結直腸癌細胞中的表達下調，外源miR- 485- 5p通過調節CD147抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲。這些發現為我們提供了一個新的視角，可能有助于開發一些新的有價值的結直腸癌預防和治療方法。另一方面，導致miR- 485- 5p表達下調的機制以及miR- 485- 5p抑制結直腸癌發生發展的機制仍需進一步研究。