柚皮苷通過調控AKT活化影響人肺癌H1299細胞增殖、凋亡和遷移

樸雪梅，楊威，金利民，李浩源

(1.吉林省延邊婦幼保健院 藥劑科,吉林 延吉 133001；2.吉林大學中日聯誼醫院肝膽胰外科，吉林 長春 130033)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，已成為癌癥相關死亡的主要原因，其預后效果差，肺癌患者的5年生存率只有15%左右，給患者的健康造成了極大的危害[1- 2]。目前，治療肺癌的主要手段是手術、放療以及化療，但是化療產生的藥物耐受和嚴重的副作用使應用化療藥物治療肺癌受到了很多限制。因此，尋找以及開發低毒且有效的天然藥物顯得日臻重要。柚皮苷屬于雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科橘柑屬類植物中，是一種次級代謝產物以及天然的苦味劑，其對人體毒副作用比較小[3]。已有研究報道，柚皮苷具有抗氧化、抗炎、抗細胞增殖以及抗腫瘤等多種生物學作用[4- 7]。目前，柚皮苷對宮頸癌[8]、卵巢癌[9]、肝癌[10]以及結腸癌[11]的增殖具有抑制作用，進而發揮抗腫瘤效應。研究表明，凋亡相關蛋白Bcl- 2和Bax等活化后進入線粒體，進而促進線粒體膜對細胞色素C的釋放，這反過來又誘導Caspase級聯反應及其底物的激活，最終導致細胞凋亡的發生[12]。細胞凋亡發生過程中，Caspase- 3是一種重要的凋亡執行蛋白。正常細胞的Caspase- 3活性很低，細胞發生凋亡后其活性明顯升高[13]。柚皮苷作為一種天然低毒的抗腫瘤化合物，其在肺癌中的作用研究尚缺乏，因此本研究擬探討柚皮苷對肺癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌細胞H1299購自中科院上海細胞庫，柚皮苷購自南京澤朗醫藥公司，RPMI- 1640培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，Annexin V- FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自中國杭州聯科生物技術股份有限公司，Transwell小室購自北京基尼亞生物技術有限公司。Bcl- 2抗體以及Bax抗體AKT和p- AKT均購自美國Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購自北京博奧森生物公司，二抗購自武漢博士德生物公司，Caspase- 3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司。

1.2 H1299細胞培養及實驗分組

復蘇H1299細胞后，加入含10%胎牛血清的1640完全培養基，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。等到細胞的融合度為90%左右進行細胞傳代。細胞分為對照組(NC)、10 μmol·L-1柚皮苷處理組、20 μmol·L-1柚皮苷處理組和40 μmol·L-1柚皮苷處理組。

1.3 MTT法檢測定細胞增殖

取生長狀態良好的H1299細胞，以每孔1 000個細胞的密度均勻接種到96孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h。等到細胞貼壁后用不同濃度的柚皮苷處理細胞24、48、72 h。每組設置6個復孔。藥物作用終止前4 h向每孔中加入20 μl MTT(5 mg·ml-1)繼續培養，4 h后用移液槍吸棄MTT，加入體積為150 μl的DMSO，放置培養箱中繼續孵育30 min，在波長為490 nm的條件下用酶標儀讀取每孔的吸光度值(OD值)。

1.4 流式細胞技術檢測細胞凋亡

取生長狀態良好的H1299細胞，以每孔3×105個的細胞密度均勻接種于6孔板中。等到細胞貼壁后用不同濃度的柚皮苷處理細胞，繼續孵育24 h后，用PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min收集細胞。用Binding buffer(500 μl)對細胞進行重懸后加入Annexin V- FITC(5 μl)和PI(10 μl)充分混勻，避光孵育5 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.5 Western blotting法檢測Bcl- 2、Bax蛋白的表達

用不同濃度的柚皮苷處理細胞24 h后，按照試劑說明書對各組細胞的蛋白進行提取。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白濃度，配置濃度為12%的分離膠，經聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)凝膠電泳。電泳結束后進行濕轉法轉膜，電流大小恒為250 mA，時間為120 min。然后用5%脫脂牛奶對PVDF膜進行封閉。封閉結束后于4 ℃條件下，用一抗稀釋液(anti- Bcl- 2,1∶1 000;anti- Bax,1∶1 000;anti- p- AKT,1∶1 000;anti- AKT,1∶1 000;anti- GAPDH,1∶1 000)對PVDF膜進行過夜孵育。用TBST洗滌PVDF膜3次(10 min·次-1)，在搖床上進行洗滌。室溫孵育二抗，孵育60 min后用TBST洗滌PVDF膜3次(10 min·次-1)，在搖床上進行洗滌。最后用成像儀顯影。用GAPDH作為內參，比較分析各組目的蛋白表達水平的差異。

1.6 比色皿法檢測H1299細胞中Caspase- 3活性

取生長狀態良好的H1299細胞，以每孔3×105個的細胞密度均勻接種于6孔板中，放于5% CO2、37 ℃條件下培養。等到細胞貼壁后，用不同濃度的柚皮苷處理細胞，繼續孵育24 h。去除上清，每孔加入100 μl預冷的裂解液，放置于冰上裂解15 min。然后，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清。參照Caspase- 3活性檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測細胞內Caspase- 3蛋白活性。最后，在波長為405 nm的條件下，用酶標儀讀取OD值，并建立標準曲線，算出Caspase- 3活性，設對照組Caspase- 3活性為1。

1.7 細胞遷移實驗

將不同濃度柚皮苷處理24 h的各細胞懸液 200 μl (細胞接種密度為1×105個·ml-1)分別加入到上室中，并用無血清培養基培養，下室則加入體積為500 μl含有10%血清的DMEM培養液。放置于培養箱內繼續孵育。24 h后取出小室并移去上室內培養液。用棉棒輕輕擦去小室膜表面未穿過的細胞，用4%多聚甲醛固定細胞10 min。PBS洗滌后再用1%結晶紫染色液染色，PBS洗滌后用倒置顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野進行拍照，計算發生遷移的細胞數。

1.8 統計學處理

本研究的實驗數據用均數±標準差表示，應用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析，組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 柚皮苷對肺癌H1299細胞增殖的影響

MTT結果顯示，10、20和40 μmol·L-1的柚皮苷處理H1299細胞后，其細胞活力顯著降低，且呈劑量和時間依賴性，見表1。

2.2 柚皮苷對肺癌H1299細胞凋亡的影響

Annexin V- FITC/PI雙染流式結果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理H1299細胞24 h可明顯增加細胞的凋亡率，見圖1。

2.3 柚皮苷對肺癌H1299細胞Bcl- 2、Bax蛋白表達水平的影響

Western blotting檢測結果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細胞24 h可顯著降低H1299細胞內Bcl- 2蛋白表達水平(P<0.05)，Bax蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖2。

組 別 OD值24 h48 h72 h空白對照組0.524±0.0250.703±0.0430.889±0.03110 μmol·L-1柚皮苷處理組0.375±0.016a0.425±0.027a0.513±0.053a20 μmol·L-1柚皮苷處理組0.267±0.022a0.284±0.009a0.265±0.068a40 μmol·L-1柚皮苷處理組0.195±0.065a0.137±0.025a0.109±0.046a

與對照組比較，aP<0.05

2.4 柚皮苷對肺癌H1299細胞Caspase- 3活性的影響

柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細胞24 h可顯著增加H1299細胞Caspase- 3活性，且隨著柚皮苷濃度的增加而增加。見表2。

2.5 柚皮苷對肺癌H1299細胞遷移的影響

Transwell結果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)處理細胞24 h可顯著抑制H1299細胞的遷移，且這種抑制作用具有濃度依賴性。見圖3。

2.6 柚皮苷對肺癌H1299細胞AKT活化的影響

濃度為10、20、40 μmol·L-1的柚皮苷處理細胞24 h后，H1299細胞的p- AKT/AKT水平顯著降低，表明柚皮苷抑制肺癌H1299細胞AKT的活化。見圖4。

3 討 論

柚皮苷屬于天然黃酮類化合物，許多研究已證實柚皮苷具有抗細胞增殖、抗腫瘤效應[14,9]。研究進一步發現，柚皮苷的抗腫瘤作用與它的苯環取代基相關，其中位于A酚環上的糖結合物的種類發揮重要作用，B環上連有羥基也同樣表現出很強的抗腫瘤效應，例如羥基連在B環上3、4和5的位置或者B環有飽和的C環和一鄰位酚結構就會表現出極強的抗腫瘤生物活性[15]。研究資料顯示，柚皮苷主要通過抑制癌細胞的增殖、促使癌細胞發生凋亡、抑制癌基因的表達等產生抗腫瘤作用[16]。黃酮類的抗細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用受到了廣大學者的關注，很多學者對有關柚皮苷誘導細胞凋亡以及細胞發生癌變的物理和化學因子進行了一系列研究[17- 18]。Camargo等[19]研究發現，一定濃度的柚皮苷可對大鼠W256癌肉瘤的生長產生抑制作用。但是，目前柚皮苷在肺癌中的研究尚未見報道。本研究發現柚皮苷可明顯抑制肺癌H1299細胞的增殖，隨著柚皮苷作用濃度的增加和處理時間的延長，這種抑制作用越來越強。這表明柚皮苷可顯著抑制肺癌細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴關系。

圖1不同濃度柚皮苷對H1299細胞凋亡率的影響

與對照組比較，aP<0.05, bP<0.01

圖2不同濃度柚皮苷對H1299細胞Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響

組 別Caspase-3活性空白對照組1.01±0.0210 μmol·L-1柚皮苷處理組1.57±0.08a20 μmol·L-1柚皮苷處理組2.23±0.05a40 μmol·L-1柚皮苷處理組2.69±0.07a

與對照組比較,aP<0.05

與對照組比較，aP<0.05

圖3不同濃度柚皮苷對H1299細胞遷移的影響

誘導腫瘤細胞發生凋亡是抗癌藥物發揮效應的重要途徑。AnnexinV- FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率的結果顯示，柚皮苷能增加肺癌H1299細胞的凋亡率，且呈劑量依賴關系。細胞凋亡的發生是受到很多相關基因調控的，如Bcl- 2家族在其中發揮重要功能。Bcl- 2是首個被發現的凋亡抑制基因，它主要位線粒體核膜和外膜等，可通過抑制細胞色素C等促凋亡分子的釋放，保持細胞內鈣離子的穩定，減弱自由基的堆積，抑制染色質發生濃縮和裂解，進而抑制凋亡的發生[20]。此外，Bcl- 2能夠抑制線粒體釋放細胞色素C，并阻止它的合成。Bax作為Bcl- 2的同源性蛋白，可發揮促進細胞凋亡的功能。它能夠改變線粒體的通透性，誘導細胞色素C的釋放，進而啟動Caspase相關的凋亡級聯反應，最終誘導細胞凋亡[21]。我們的研究結果顯示，柚皮苷(10、20、40 μmol·L-1)可下調抗凋亡蛋白Bcl- 2的表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達。Caspase是凋亡過程的核心因子，活化的Caspase- 3能夠特異性切割不同底物，對細胞質、細胞核和細胞骨架的重要蛋白質進行降解，最終誘導凋亡的發生[13]。于是，我們進一步探討了柚皮苷對肺癌H1299細胞Caspase- 3活性的影響。結果顯示，柚皮苷處理可明顯增加肺癌H1299細胞Caspase- 3的活性，且隨著柚皮苷濃度的增加而增加。以上結果表明，柚皮苷誘導H1299細胞凋亡可能是通過影響Bcl- 2、Bax蛋白表達水平以及Caspase- 3活性實現的。

與對照組比較，aP<0.05

圖4不同濃度柚皮苷對H1299細胞AKT活化的影響

研究表明，細胞遷移與腫瘤的發生發展密切相關[22- 24]。本研究還進一步探討了柚皮苷對人肺癌H1299細胞遷移能力的影響。Transwell結果顯示，柚皮苷可濃度依賴性地抑制H1299細胞的遷移。研究報道，AKT活化在腫瘤的發生發展中具有重要作用[25]。同樣，AKT活化也與肺癌的發生發展密切相關[26]。因此，本研究探也討了柚皮苷對人肺癌H1299細胞AKT活化的影響。結果顯示，柚皮苷處理H1299細胞后，其p- AKT/AKT水平顯著降低，表明柚皮苷可抑制肺癌H1299細胞AKT的活化。

本研究結果表明，柚皮苷對人肺癌細胞的增殖和遷移具有抑制作用，其機制可能與其抑制AKT的活化有關，本研究的發現可為柚皮苷體外抗腫瘤機制的研究提供理論依據。