無創性延遲肢體缺血預適應對腦缺血再灌注大鼠存活素和血管內皮生長因子表達的影響

魯慧，王彬成，崔寧寧，張艷春，楊蘭

(1.滄州市中心醫院 神經內科，河北 滄州 061000；2.河北醫科大學第二醫院 神經內科，河北 石家莊 053600)

缺血性腦血管疾病致殘率和致死率比較高，是常見的神經系統疾病，腦血管疾病的發病年齡趨向年輕化，對患者的心理和生活質量造成嚴重影響，因此降低腦梗死的發病率以及減輕腦梗死后腦損傷具有重要意義[1]。腦血管疾病常用的治療方法主要為手術治療、藥物治療、介入治療等[2]，這些方法的特點為采用外來的、被動的手段作用于機體，沒有發揮和調動機體的主動抗病能力。肢體缺血預適應對遠端的心臟、腦、肝臟等組織器官具有保護作用[3]。存活素在抑制細胞凋亡方面具有重要作用[4]，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有比較強的促進血管生成的作用[5]，存活素和VEGF在缺血性腦損傷中具有重要作用。本研究對腦缺血再灌注大鼠進行無創性延遲肢體缺血預適應，觀察其對腦梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF表達的影響，探討無創性延遲肢體缺血預適應對腦缺血再灌注大鼠的腦保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康清潔級8周齡雄性SD大鼠90只,購自北京醫療器械檢驗所，許可證號SYXK為(京)2015-0006。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠存活素多克隆抗體、VEGF多克隆抗體和β- actin(美國Sigma公司)，免疫組化二步法檢測試劑盒(中山金橋生物技術有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 大鼠水合氯醛麻醉成功后，取正中切口暴露大鼠左側頸總、頸外、頸內動脈，結扎頸外動脈，動脈夾夾閉頸內動脈遠心端和頸總動脈近心端，在頸外動脈結扎處近心端剪開一小口，將栓線插入頸內動脈栓塞左側大腦中動脈，栓線長度18～20 mm，缺血1 h后抽出栓線形成再灌注，再灌注24 h。腦缺血再灌注成功的標志：大鼠麻醉清醒后出現神經缺損癥狀，包括右下肢伸直、站立不穩、右上肢癱瘓、提尾時右前肢內收、右肩內旋、雙前肢肌張力和抓力不等等癥狀。

1.3.2 建立無創性肢體缺血預適應大鼠模型 大鼠水合氯醛麻醉成功后，在左后肢根部用動物無創血壓測試儀自制套管套住，將脈搏傳感器緊貼在足背動脈上連續監測脈搏和血壓。加壓阻斷股動脈，股動脈阻斷的標志為脈搏消失、皮膚發紺、肢體遠端體溫下降，股動脈阻斷5 min，減壓再灌注，再灌注的標志為脈搏出現、皮膚潮紅、體溫回升，再灌注5 min，共3個循環。

1.3.3 動物分組和處理 根據隨機數字法將90只大鼠分為假手術組(sham組)、腦缺血再灌注損傷組(I/R組)、腦缺血再灌注損傷+無創性延遲肢體缺血預適應組(I/R+NDLIP組)，每組30只，10只用于腦梗死范圍測定，10只用于梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞測定，10只用于梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白的測定。Sham組大鼠游離左側頸總動脈但不夾閉；I/R組腦缺血1 h、再灌注24 h；I/R+NDLIP組左后肢缺血5 min、再灌注5 min共3個循環，每天1次，連續3 d，第4天腦缺血1 h、再灌注24 h。

1.3.4 大鼠神經缺損癥狀和行為評分測定 大鼠缺血1 h、再灌注24 h后觀察神經缺損癥狀并進行行為評分：(1) 提起鼠尾，如果雙前肢對稱伸向地面為0分；如果右側前肢出現腕屈曲為1分、肘屈曲為2分、肩內旋為3分，既有腕肘屈曲又有肩內旋為4分；(2) 將大鼠置于平滑地面上推雙肩向對側移動，雙側阻力對稱為0分，左肩向右側移動阻力下降者，根據阻力下降程度分為1～3分；(3) 將大鼠雙前肢置金屬網上，兩前肢肌張力對稱為0分，右側前肢肌張力下降者，根據肌張力下降程度分為1～3分；(4) 大鼠不停向一側轉圈者為1分。總分11分，分值越高神經損傷越嚴重。

1.3.5 腦梗死范圍測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，剔除小腦、低位腦干、嗅腦，沿冠狀面切4刀將腦組織切成5片，置于含K2HPO4和TTC溶液中孵育30 min，正常腦組織被染色為玫瑰紅色，腦梗死區被染色為白色。將腦組織置于福爾馬林中固定24 h，取出稱取腦組織總濕重，刀片剔下腦梗死組織，稱取腦梗死組織濕重，腦梗死范圍為腦梗死組織濕重/腦組織總濕重×100%。

1.3.6 各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，經多聚甲醛固定，取前囟前1 mm至前囟后2 mm之間腦組織，切塊、沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后取冠狀腦組織切片，采用免疫組化二步法進行免疫組化染色，腦組織皮質區存活素和VEGF陽性細胞呈棕黃色，取梗死灶周邊皮質區5個視野，高倍鏡下計數陽性細胞數，取平均數。

1.3.7 各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白表達量測定 缺血1 h、再灌注24 h后斷頭處死大鼠，取出腦組織，取右側大腦半球缺血半暗區皮質腦組織勻漿后去上清，提取總蛋白，采用Western blotting法測定存活素和VEGF蛋白表達，一抗為兔抗大鼠存活素、VEGF多克隆抗體，以β- actin為內參照，存活素、VEGF蛋白的相對表達量=存活素、VEGF條帶灰度值/β- actin條帶灰度值。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠神經缺損癥狀和行為評分情況

sham組大鼠未出現神經缺損癥狀，I/R組和I/R+NDLIP組均出現神經缺損癥狀，神經缺損癥狀主要表現為提尾懸空時右側前肢肌張力下降、肩部內旋、前肢內收。I/R組神經缺損癥狀和行為評分明顯升高，I/R+NDLIP組大鼠神經缺損癥狀和行為評分低于I/R組(t=5.588，P=0.000)。見表1。

表1各組大鼠神經缺損癥狀和行為評分

組 別神經缺損癥狀和行為評分sham組0I/R組9.73±0.98I/R+NDLIP組5.90±0.71

2.2 各組大鼠腦梗死范圍

sham組大鼠未見腦梗死區域，I/R組和I/R+NDLIP組大鼠均見腦梗死區域，經TTC染色后，腦梗死區呈白色，正常腦組織呈紅色。I/R+NDLIP組大鼠腦梗死范圍明顯低于I/R組(t=6.748，P=0.000)。見表2。

表2各組大鼠腦梗死范圍

組 別腦梗死范圍/%sham組0I/R組16.26±3.18I/R+NDLIP組10.75±1.39

2.3 各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞比較

I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞均高于sham組(P<0.05)，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞均高于I/R組(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4 各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白相對表達量比較

I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白相對表達量均高于sham組(P<0.05)，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白相對表達量均高于I/R組(P<0.05)。見表4。

表3各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞比較

組 別n存活素陽性細胞/個·HP-1VEGF陽性細胞/個·HP-1Sham組103.49±0.374.10±0.38I/R組1031.30±2.25a36.35±1.84aI/R+NDLIP組1038.65±3.26ab44.56±2.08abt值6.4311.359P值0.0000.000

與sham組比較，aP<0.05，與I/R組比較，bP<0.05

表4各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF蛋白相對表達量比較

組 別n存活素蛋白相對表達量VEGF蛋白相對表達量Sham組100.44±0.020.53±0.02I/R組101.19±0.05a1.03±0.08aI/R+NDLIP組101.57±0.07ab1.43±0.06abt值12.9205.413P值0.0000.000

與sham組比較，aP<0.05，與I/R組比較，bP<0.05

圖1各組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞(×400)

3 討 論

遠隔缺血預適應是指對骨骼肌、小腸、腎臟等組織的缺血預處理可減輕局部器官或組織隨后的缺血再灌注損傷，對心臟、腦、腎、肝臟、胰腺等遠端組織器官也有保護作用[6- 7]。遠隔缺血預適應可通過對機體不太重要的器官組織的缺血預適應來保護心臟、腦等重要器官[8- 9]；小腸和腎臟的缺血預處理均需要手術完成，為有創性操作[10]，且小腸和腎臟對缺血損傷比較敏感，反復短時間的血供阻斷和恢復有可能對小腸和腎臟造成損傷；骨骼肌的缺血預適應可采用捆綁止血帶的無創方法進行血流阻斷，且骨骼肌對缺血的耐受性比較強，引起肢體缺血預適應可行性強、操作簡單，使其在臨床上具有巨大的應用潛能[11- 13]。本研究對腦缺血再灌注大鼠進行無創性延遲肢體缺血預適應，結果發現：sham組大鼠未出現神經缺損癥狀、未見腦梗死區域，I/R組和I/R+NDLIP組大鼠均出現神經缺損癥狀、見腦梗死區。I/R+NDLIP組大鼠神經缺損癥狀和行為評分、腦梗死范圍低于I/R組。可見，無創性延遲肢體缺血預適應可減輕腦缺血再灌注大鼠的神經缺損癥狀及腦梗死面積，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

存活素是強大的凋亡抑制蛋白，可通過與細胞周期調節因子結合阻斷凋亡信號、阻止細胞色素C釋放、抑制半胱氨酸蛋白酶活化等機制發揮抑制凋亡的作用；存活素還具有促進血管生成的作用，其機制可能為存活素可促進血管內皮細胞增殖、抑制血管內皮細胞凋亡，介導堿性成纖維細胞、血管內皮生長因子等參與血管形成[14]。存活素在正常成熟組織中無表達或低表達，在腫瘤組織中呈強表達，在受損的腦組織中也呈高表達[15- 16]。VEGF具有顯著的促進血管生成的作用，對循環系統和中樞神經系統的功能和發育具有重要作用；VEGF可選擇性地與內皮細胞膜上的血管內皮生長因子受體結合，引起血管內皮細胞的增殖和遷移，從而促進血管生成[17- 18]；VEGF為作用于血管內皮細胞的特異性和活性最強的關鍵性因子，對缺血性腦血管疾病具有重要的保護作用[19]。本研究對腦缺血再灌注大鼠進行無創性延遲肢體缺血預適應，觀察其對大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF表達的影響，結果發現：I/R組和I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞和蛋白表達量均高于sham組，I/R+NDLIP組大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF陽性細胞和蛋白表達量均高于I/R組。可見，腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF表達增加，存活素和VEGF對腦缺血再灌注大鼠具有腦保護作用，存活素可能通過抑制神經細胞凋亡發揮對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用；VEGF對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用可能與VEGF促進血管新生有關，通過抑制神經細胞凋亡發揮對神經元的保護作用。無創性延遲肢體缺血預適應可進一步提高大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF表達，其對腦缺血再灌注大鼠腦組織的保護作用可能與其上調大鼠梗死灶周邊皮質區存活素和VEGF表達有關。