Survivin- siRNA敏感腫瘤株的篩選及其侵襲和遷移的作用機制研究

周偉華

(宜春學院 化學與生物工程學院，江西 宜春 336000)

惡性腫瘤是當今威脅人類生命健康的主要殺手之一，并且惡性腫瘤的治療是長期困擾醫學界的世界性難題。Survivin基因是近年新發現的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員，在腫瘤發生、發展中起關鍵作用，在腫瘤細胞及胚胎組織中呈高表達，而在成人絕大多數正常組織中被關閉而很少表達[1- 3]。RNA干擾技術是近幾年興起的生物技術，用小分子干擾RNA(siRNA)干擾特定基因的表達是基因治療的重要組成部分。本研究運用RNA干擾技術和抗腫瘤藥物篩選平臺，設計篩選高效的靶向Survivin基因的抗腫瘤siRNA前體藥物，并探討其抑制腫瘤細胞侵襲和遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細胞株 非小細胞肺癌細胞株H1299、肝癌細胞株SMMC- 7721、甲狀腺癌細胞株8505C、乳腺癌細胞株MCF- 7、結腸腺癌細胞株HCT- 116、食管癌細胞株EC109，均由中科院上海生命科學研究院細胞庫提供。

1.1.2 主要藥品與試劑 Survivin siRNA脂質體(1 mg·L-1)，由本課題組制備。RPMI- 1640培養基(美國Invitrogen Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、Trizol試劑(美國Sigma公司)，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，Survivin抗體、基質金屬蛋白酶- 9(matrix metalloproteinases- 9，MMP- 9)抗體和粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抗體(英國Abcam公司)，胎牛血清、β- actin抗體、HRP- 羊抗鼠IgG、ECL Prime蛋白印跡試劑(上海碧云天生物公司)。Survivin、MMP- 9、FAK和GAPDH引物序列均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及產物長度見表1。

表1引物序列和產物長度

名 稱序列產物長度/pbSurvivin正向引物:5'-GACAGATGAAGGTTGGG-3'反向引物:5'-AGGTGGATGAGGAGACAGA-3'228MMP-9正向引物:5'-AAATGTGGGTGTACACAGGC-3'反向引物:5'-TTCACCCGGTTGTGGAAACT-3'310FAK正向引物:5'-TTGCGGAGAATATGGCTGAC-CTAA-3'反向引物:5'-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGT-TC-3'116GAPDH正向引物:5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3'反向引物:5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'110

1.1.3 主要儀器 低溫離心機(德國Eppendorf公司)，超微量分光光度計(美國Molecular Devices公司)，定量PCR儀、Western blotting電泳儀、凝膠成像分析系統(美國BIORAD公司)，Fluor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(美國Alpha公司)。

1.2 方法

1.2.1 Survivin siRNA脂質體的制備 根據Invitrogen公司的網上設計系統(http:www.invitrogen.com)進行Survivin基因的siRNA片段設計。Survivin- siRNA序列的正義鏈為5′- GAAGCAGUUUGAAGAAUUATT- 3′，反義鏈為5′- UAAUUCUUCAAACUGCUUCTr- 3′。Survivin- siRNA序列均由杭州四季青生物工程公司制備。在攪拌條件下將siRNA加入陽離子脂質、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇(4∶1∶4∶1)混合物，超聲10 min，形成Survivin- siRNA脂質體(1 mg·ml-1)。

1.2.2 腫瘤細胞的培養 從液氮中取出凍存的H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細胞株，復蘇后轉入培養瓶，用含10%(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培養基于5%CO2、37 ℃條件下培養，每48 h更換1次培養基，當細胞長滿90%時進行消化、傳代，取第3代細胞用于實驗。

1.2.3 MTT法篩選Survivin- siRNA的敏感腫瘤菌株 取對數生長期的H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細胞，常規消化，離心，重懸細胞并調整至1×105個·ml-1，加入96孔培養板，每孔100 μl。在細胞培養箱中培養24 h使細胞貼壁后，在各培養孔分別加入不同濃度的Survivin- siRNA脂質體，終濃度分別0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0和100.0 μg·ml-1，每個濃度設6個平行孔，同時設陰性對照組為等體積空白脂質體。繼續培養48 h后每孔加入5 mg·ml-1MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后棄上清液，加DMSO 150 μl·孔-1，振蕩溶解15 min，立即用分光光度計測定在570 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率。選擇對Survivin- siRNA最敏感的腫瘤株8505C進行后續試驗。

1.2.4 癌細胞遷移實驗 在培養板加入甲狀腺癌細胞株8505C 1×105個·孔-1，培養至細胞鋪滿單層。用100 μl移液槍頭沿培養板底部垂直劃線，用PBS沖洗，分別加入不同濃度的Survivin- siRNA脂質體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時設陰性對照組為等體積空白脂質體，培養24 h后拍照，測量間距。各組設6個復孔。

1.2.5 癌細胞侵襲實驗 制備Transwell小室(上室)，加入100 μl密度為105個·ml-1對數生長期的8505C細胞，將上室放入細胞培養板孔(下室)。下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時設陰性對照組為等體積空白脂質體。培養24 h后取出上室，用棉簽將上室內細胞刮除，用多聚甲醛固定，染色，雙蒸水沖洗上室，在相差顯微鏡下進行細胞計數。各組設6個復孔。

1.2.6 RT- PCR實驗 在培養板加入甲狀腺癌細胞株8505C 1×105個·孔-1，各孔分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時設陰性對照組為等體積空白脂質體。將96孔板置于5 % CO2、37 ℃培養箱內培養48 h。Trizol提取細胞總RNA，用超微量分光光度計測定260和280 nm的吸光度值，以RNA電泳檢測其完整性。取總RNA進行cDNA合成。采用RT- PRC儀測定Survivin、MMP- 9和FAK mRNA的表達水平。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，循環35次，72 ℃延伸10 min。Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達量以內參物GAPDH的相對定量表示。

1.2.7 Westen blotting實驗 在培養板加入甲狀腺癌細胞株8505C 1×105個·孔-1，各培養孔分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時設陰性對照組為等體積空白脂質體。各組細胞分別培養48 h，收集細胞，加入RIPA裂解液，冰浴，離心，取上清液測定蛋白濃度。制備SDS- PAGE凝膠，加樣后電泳，電轉至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Survivin、MMP- 9和FAK抗體，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP- 羊抗鼠IgG，25 ℃孵育1 h，洗膜，顯色，顯影。Survivin、MMP- 9和FAK的表達量以各自吸光度值與β- actin吸光度值比值表示。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0進行數據分析，各組數據采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Survivin- siRNA對多種腫瘤細胞增殖的影響

Survivin- siRNA對H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細胞株均有一定程度的抑制作用，見圖1。其中，Survivin- siRNA對8505C細胞株抑制作用最強(IC50=5.83 μg·ml-1)，選擇8505C細胞株為Survivin- siRNA敏感菌株進行后續研究。

圖1Survivin-siRNA對多種腫瘤細胞增殖的抑制作用(n=6)

2.2 Survivin- siRNA對甲狀腺癌8505C細胞遷移的影響

在腫瘤細胞遷移實驗中，1 μg·ml-1組和陰性對照組劃痕刻度差異均無統計學意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組劃痕刻度較陰性對照組顯著增大(P<0.01)，并且10 μg·ml-1組劃痕刻度較3 μg·ml-1組顯著增大(P<0.05)，見圖2。

與陰性對照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖2Survivin-siRNA對甲狀腺癌8505C細胞遷移的影響(n=6)

2.3 Survivin- siRNA對甲狀腺癌8505C細胞侵襲的影響

在腫瘤細胞侵襲實驗中，1 μg·ml-1組和陰性對照組穿膜細胞數量差異無統計學意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組穿膜細胞數量較陰性對照組顯著減少(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組穿膜細胞數量較3 μg·ml-1組顯著減少(P<0.05)，見圖3。

與陰性對照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖3Survivin-siRNA對甲狀腺癌8505C細胞侵襲的影響(n=6)

2.4 Survivin- siRNA對甲狀腺癌8505C細胞Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達的影響

在RT- PCR實驗中，1 μg·ml-1組和陰性對照組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達差異均無統計學意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達較陰性對照組顯著降低(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達較3 μg·ml-1組顯著降低(P<0.05)，見圖4。

與陰性對照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖4Survivin-siRNA對甲狀腺癌8505C細胞Survivin、MMP-9和FAKmRNA表達的影響(n=6)

2.5 Survivin- siRNA對甲狀腺癌8505C細胞Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達的影響

在Western blotting實驗中，1 μg·ml-1組和陰性對照組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達較陰性對照組顯著降低(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達較3 μg·ml-1組顯著降低(P<0.05)，見圖5。

與陰性對照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖5Survivin-siRNA對甲狀腺癌8505C細胞Survivin、MMP-9和FAK蛋白表達的影響(n=6)

3 討 論

siRNA是近10年來分子生物學領域最突出的發現之一，siRNA技術不但是研究功能基因強有力工具，而且也是基因治療行之有效的武器。應用siRNA技術干擾特定致病基因的表達是基因治療的重要組成部分，這為某些惡性疑難疾病的治療帶來了新希望。國內外研究發現Survivin是腫瘤發生、發展中起關鍵作用的基因之一，該基因在腫瘤細胞中表達水平異常升高，而在成人絕大多數正常組織中被關閉。該基因在腫瘤細胞中高表達后不僅促進細胞抗凋亡[4]、加速細胞有絲分裂[5]，還增加腫瘤細胞對放化療的耐受性[6]，促進腫瘤組織血管的形成。靶向該基因的抗腫瘤基因治療藥物的毒副作用可能較小，安全性較好。本研究在H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細胞株中篩選對Survivin- siRNA敏感的菌株，結果顯示Survivin- siRNA對上述6種腫瘤細胞株均有一定程度的抑制作用，但是Survivin- siRNA對8505C細胞株抑制作用最強。因此將Survivin- siRNA的目標腫瘤鎖定為甲狀腺癌，選擇8505C細胞株為Survivin- siRNA敏感菌株進行后續研究。

侵襲和遷移是甲狀腺癌治療失敗的最常見原因，也是腫瘤細胞轉移的原因。侵襲是腫瘤細胞降解細胞外基質向局部臨近組織的浸潤，而轉移是腫瘤細胞突破血管膜或淋巴管膜并在其他器官生長。在癌細胞遷移實驗中，3 μg·ml-1和10 μg·ml-1Survivin- siRNA劃痕刻度較陰性對照組顯著增大(P<0.01)，并且10 μg·ml-1組劃痕刻度較3 μg·ml-1組顯著增大(P<0.05)，說明Survivin- siRNA可劑量依賴性抑制甲狀腺癌8505C細胞的遷移；在癌細胞侵襲實驗中，3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組穿膜細胞數量較陰性對照組顯著減少(P<0.05)，并且10 μg·ml-1組穿膜細胞數量較3 μg·ml-1組顯著減少(P<0.05)，說明Survivin- siRNA可劑量依賴性抑制甲狀腺癌8505C細胞的侵襲。

細胞和細胞基質間的信號通路失衡是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要原因之一[7]。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，其作為多條信號通路的上游分子廣泛參與細胞的多種生物學過程。FAK活化后可通過細胞外信號調節激酶途徑引起級聯反應，促進細胞增殖、轉移和侵襲，因此FAK的高表達與腫瘤的轉移、侵襲有關[8- 9]。MMPs是一組降解細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)的鋅離子依賴內肽酶，在腫瘤的生長、侵襲和轉移中發揮至關重要的作用[10]。目前已確定的MMPs有26種，其中MMP- 9可降解ECM中的Ⅳ型以及Ⅴ型膠原纖維[11]，參與腫瘤組織轉移[12- 13]。本研究結果顯示，3 μg·ml-1和10 μg·ml-1Survivin- siRNA可顯著降低甲狀腺癌8505C細胞中Survivin、MMP- 9和FAK mRNA和蛋白的表達，說明Survivin- siRNA抗甲狀腺癌細胞侵襲和遷移的作用可能與其抑制Survivin、MMP- 9和FAK表達有關。

總之，Survivin- siRNA作為新型的抗腫瘤藥物對甲狀腺癌8505C細胞增殖具有較強的抑制作用，并且可以抑制8505C細胞的遷移和侵襲，這可能與其抑制細胞Survivin、MMP- 9和FAK的表達有關。