AEG- 1調控eIF4E表達促進胃癌細胞遷移的作用機制

徐可心，吳丹丹，吳圣潔，王雪融

(南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 藥理學系，江蘇 南京 210029)

胃癌是世界第5大常見惡性腫瘤，在癌癥相關死亡中占第3位[1]。因此，了解胃癌轉移的分子機制，尋找胃癌轉移中起重要作用的分子尤為重要。星形膠質細胞上調基因- 1(astrocyte elevated gene- 1，AEG- 1)[2]也被稱為metadherin(MTDH)或者lysine- rich CEACAM- 1 associated protein(LYRIC)，研究證實它參與了乳腺癌的肺部轉移[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AEG- 1的表達與多種腫瘤例如乳腺癌[4]、肺癌[5]、結腸癌[6]、肝癌[7]、胃癌[8]等的臨床分型、分期、轉移和預后密切相關。既往研究表明，AEG- 1可通過激活PI3K/Akt、MAPK/ERK、NF- κB和Wnt/β- catenin等信號通路促進細胞增殖、存活、代謝、上皮- 間質樣轉化(epithelial- mesenchymal transition，EMT)、遷移、侵襲、保護性自噬和血管形成等[9]。然而，AEG- 1在胃癌遷移中的作用機制尚未明確。

EMT是腫瘤轉移的起始和關鍵步驟，腫瘤細胞遷移的一個重要標志就是腫瘤細胞發(fā)生了EMT。真核翻譯起始因子4E(eIF4E)是翻譯起始復合物的一個重要組成成分[10]，既往研究表明eIF4E在細胞生長、存活、侵襲、EMT和血管生成中起重要作用，在多種腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)eIF4E促進腫瘤形成、轉移和復發(fā)[11]。提示eIF4E可作為腫瘤診斷的分子標志物及治療的新靶點[12]。本研究的目的是明確AEG- 1通過上調eIF4E表達促進胃癌細胞的遷移，為eIF4E作為腫瘤診斷的分子標志物及治療的新靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Lipofectamine 2000?transfection reagent(11668- 019)購自美國Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；AEG- 1/MTDH抗體(13860- 1- AP)購自中山金橋生物技術有限公司(中國北京)；eIF4E抗體(9742)購自Cell Signaling Technology.Inc(Beverly，MA，USA)；AEG- 1質粒是在pcDNA的空載體中插入編碼AEG- 1的全長DNA序列(由寧夏醫(yī)科大學劉坤梅教授饋贈)；eIF4E質粒是在p3×flag- CMV- 14的空載體中插入編碼eIF4E的全長DNA序列(由美國Emory University的Shi- Yong Sun教授贈送)。AEG- 1、eIF4E siRNA購自上海吉瑪公司。AEG- 1 siRNA(共兩個序列)5′- CAGAAGAAGAAGAACCGGAdTdT- 3′，5′- GCAGCAAGGCAGUCUUUAAGUTT- 3′；eIF4E siRNA(共兩個序列)5′- GGACGAUGGCUAAUUACAU- 3′，5′- AAGCAAACCUGCGGCUGAUCUTT- 3′。

1.2 細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞株(SGC7901中分化腺癌)來源于上海生命科學研究院，細胞在含5%胎牛血清(FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)的RPMI 1640(Hyclone, Logan, UT, USA)培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 腫瘤細胞遷移實驗

按transwell小室說明書操作，細胞消化重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，吸取400 μl按5×104個·L-1密度接種在transwell小室的上室，吸取600 μl含0.5%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基或100 ng·ml-1CXCL12的0.5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)24 h后 取出小室，PBS清洗3次，用棉簽小心擦去小室上側的細胞，待干燥后用甲醇固定30 min，晾干后用0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下拍攝穿過濾膜進入膜下側的細胞(發(fā)生遷移的細胞)。

1.4 質粒、siRNA瞬時轉染實驗

細胞以5×105個·孔-1的密度接種于6孔板，待細胞融合度達80%～90%時用1 μg質粒、100 nmol·L-1siRNA按 Lipofectamine?2000說明書進行轉染，4～6 h后換正常培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。

1.5 Western blotting[13]

提取全細胞蛋白(裂解液即1%Triton，成分為HEPES(pH=7.5)40 mmol·L-1，EDTA 1 mmol·L-1，NaCl 120 mmol·L-1，焦磷酸鈉10 mmol·L-1，NaF 50 mmol·L-1，原釩酸鈉0.5 mmol·L-1，甘油磷酸鈉10 mmol·L-1，1% Triton X- 100，PMSF臨用前加，終濃度為1 mmol·L-1)，考馬斯亮藍法測蛋白濃度(考馬斯亮藍G- 250液：稱取0.1 g考馬斯亮藍G- 250，先加入50 ml 95%乙醇，再加100 ml 85%磷酸，單蒸水定容至1 000 ml后濾紙過濾，常溫避光保存)。Western blotting實驗即用SDS- PAGE電泳分離蛋白，電轉至PVDF膜[蛋白電泳、電轉裝置(9204355 Rev A)和電源購自美國Bio- Rad公司]后依次孵育一抗、PBST洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL顯影、熒光化學發(fā)光成像(ChemiScope 3400 Mini，購自上海勤翔科技有限公司)，具體操作過程見我們既往發(fā)表的文章[12]。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，兩組之間的比較采用雙側Student’st檢驗，數(shù)據(jù)均采用GraphPadInStat 3.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 過表達AEG- 1誘導細胞發(fā)生EMT，同時上調eIF4E的表達

為了探討AEG- 1在胃癌細胞遷移中的作用，我們首先檢測了過表達AEG- 1對EMT的影響。結果顯示，在HEK- 293T和SGC7901細胞上瞬時轉染編碼AEG- 1的質粒，與對照質粒pcDNA轉染組相比，轉染AEG- 1組的AEG- 1蛋白表達明顯增加。而且過表達AEG- 1組的細胞上，上皮細胞標志物E- cadherin表達減少，間質細胞標志物N- cadherin表達增加，提示發(fā)生了EMT。我們同時發(fā)現(xiàn)，eIF4E和cyclinD1的表達都增加，提示過表達AEG- 1上調eIF4E的蛋白表達，并誘導胃癌細胞發(fā)生EMT(圖1)。

2.2 沉默AEG- 1的表達抑制細胞發(fā)生EMT，同時下調eIF4E的表達

我們在SGC7901細胞上用lipofectamin轉染AEG- 1的siRNAs和對照siRNAs瞬時沉默AEG- 1的表達，結果顯示，與對照組相比AEG- 1siRNAs轉染組AEG- 1的蛋白表達水平明顯降低，而且沉默AEG- 1表達組E- cadherin表達上調，N- cadherin表達下調，提示抑制了EMT。同時，我們發(fā)現(xiàn)eIF4E和cyclinD1的表達下調，結果提示沉默AEG- 1下調eIF4E的表達并抑制胃癌細胞發(fā)生EMT(圖2)。

2.3 沉默AEG- 1的表達抑制胃癌細胞的遷移以及CXCL12誘導的胃癌細胞遷移，并同時下調eIF4E的表達

發(fā)生EMT是細胞遷移侵襲的初始步驟，接著我們用transwell的方法檢測了干擾AEG- 1的表達對SGC7901細胞株遷移能力的影響。結果顯示，與對照組相比，沉默AEG- 1組遷移到小室下室一側的細胞數(shù)目明顯減少，提示沉默AEG- 1表達抑制了胃癌細胞的遷移能力。我們既往研究報道CXCL12促進了胃癌細胞的遷移，因此我們接著檢測了給予CLCX12刺激對細胞遷移的影響。結果顯示，與對照組相比，CXC12組下室的細胞數(shù)目明顯增多，提示胃癌細胞的遷移能力增強；沉默AEG- 1再給予CLCX12刺激，與只給予CLCX12刺激組相比下室的細胞數(shù)目減少，但與只沉默AEG- 1組相比下室的細胞數(shù)目增多，提示沉默AEG- 1可減弱CXCL12誘導的細胞遷移(圖3A)。Western blotting結果顯示，與對照組相比，AEG- 1沉默組eIF4E和cyclin D1表達減少，CXCL12處理組二者表達增加，而既沉默AEG- 1表達又給予CXCL12處理組eIF4E和cyclin D1的表達介于上述兩組之間。提示給予或不給予CXCL12刺激時，沉默AEG- 1的表達均可抑制細胞的遷移，而且同時伴有eIF4E的表達下調，cyclinD1表達下調(圖3B)。

圖1Westernblotting檢測結果圖

NC：陰性對照

圖2Westernblotting檢測結果圖

NC：陰性對照

圖3Transwell(A)及Westernblotting(B)檢測結果圖

2.4 過表達eIF4E部分逆轉沉默AEG- 1表達引起的細胞遷移的抑制作用

上述研究都檢測到了eIF4E在AEG- 1調控胃癌細胞EMT和遷移中的伴隨變化，為了探討eIF4E在AEG- 1誘導的胃癌細胞遷移中的作用，我們在SGC7901 AEG- 1穩(wěn)定沉默的細胞株上過表達eIF4E進行transwell實驗。結果顯示，單獨沉默AEG- 1抑制細胞遷移，過表達eIF4E促進細胞遷移，而同時沉默AEG- 1和過表達eIF4E的組，穿過微孔膜的細胞數(shù)介于上述兩組之間。結果說明過表達eIF4E可以部分逆轉沉默AEG- 1的表達引起的細胞遷移的抑制(圖4)。

Control：scramble shRNA

圖4transwell檢測結果圖

3 討 論

本研究我們探討了AEG- 1在胃癌細胞遷移中的作用和機制。結果發(fā)現(xiàn)沉默AEG- 1的表達引起上皮細胞標志物E- cadherin的表達增高，間質細胞標志物N- cadherin的表達降低，提示抑制胃癌細胞發(fā)生EMT。反之過表達AEG- 1觀察到相反的變化，提示AEG- 1促進胃癌細胞發(fā)生EMT。這些結果表明AEG- 1通過誘導EMT來促進胃癌細胞的遷移。既往的研究發(fā)現(xiàn)AEG- 1通過Wnt/β- catenin和LPS/TLR4/p65NF- κB信號通路來調節(jié)胃癌細胞的生長、凋亡和炎癥反應[14- 15]，但在腫瘤遷移中的機制仍未明確。

AEG- 1下游信號分子主要有PI3K/Akt、NF- κB、MAPK/ERK、c- Myc、Wnt和cyclinD1[16]，我們的研究中也觀察到沉默AEG- 1的表達下調cyclinD 1的蛋白表達，與既往的研究報道一致。激活eIF4E的活化是某些具有較長5′- UTR結構的mRNA翻譯起始的限速步驟，在多種腫瘤轉移中起重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)過表達AEG- 1上調eIF4E的蛋白表達，沉默AEG- 1下調eIF4E的蛋白表達，提示eIF4E在AEG- 1誘導胃癌細胞發(fā)生遷移中起重要作用，但具體的調控機制仍不明確。已有的研究報道，AEG- 1通過激活PI3K/Akt信號通路激活轉錄因子FOXO1、FOXO3a、NF- κB和AP- 1[17- 19]，AEG- 1也可以直接和p65 NF- κB、SND1和PLZF相互作用來調節(jié)基因轉錄[20- 22]，都可能通過間接的機制上調eIF4E的表達。此外，在表觀遺傳學水平、eIF4E啟動子區(qū)域組蛋白和DNA修飾如乙酰化和甲基化也可能調控eIF4E的轉錄表達。因此，AEG- 1調控eIF4E的機制有待進一步研究。

綜上所述，AEG- 1通過上調eIF4E的表達促進胃癌細胞的遷移，我們的研究進一步證實了AEG- 1在胃癌細胞遷移中的重要作用以及揭示了AEG- 1通過eIF4E促進胃癌細胞遷移的分子作用機制，為胃癌轉移的治療提供了新的靶點和治療策略。