微生物修復及油污土壤改良研究

王曙光，穆 馳，林兆豐

(陜西省土地工程建設集團，陜西西安 710075)

石油被稱為工業的血脈，是我國現代化進程的重要能源之一[1]。然而，隨著石油使用量的增加，各種泄露事故造成的環境污染在石油的勘探、開采、運輸過程中越來越嚴重[2]。研究表明，全球每年約有500萬t的石油污染物進入環境，每年約有60萬t石油污染衍生物進入環境[3]。這些石油污染物以不同的渠道進入土壤，降低土壤透氣性，改變土壤結構，影響微生物種群，減少農作物產量[4-7]。污染土壤中石油主要成分為C15～C36的烷烴及苯系物酚類等，其中30多種污染物受環境優先控制[8]。

微生物修復技術是在人工增強條件下，使用天然微生物或者人造微生物起主導作用的一種方法。通過人為因素，將外來微生物添加到油污土壤，降解并去除土壤中烴類化合物[9-10]。相比傳統方法，微生物修復技術具有成本低、種類多、易變異等特點，同時，使用微生物修復技術不會破壞土壤環境，保障生態環境的完整性。

通過改變外部環境的溫度、濕度、通氣量、營養物質及微生物表面活化性，可以實現油污土壤受損修復[11-13]。借助微生物修復技術，接種高效降解菌株或者微生物群體，可以提高土壤中石油的降解率，但微生物修復技術對于難降解的復雜化合物(瀝青、石蠟等)和油污土壤難以適用，該方面技術還需深入研究[14-15]。

1 油污土壤微生物修復機理

石油烴是高分子的復雜混合物，由鏈烷烴、芳香烴、環烷烴組成。鏈烷烴的代謝機制是氧化作用和脫烴作用，通過酶的氧化作用將鏈烷烴進行降解，鏈烷烴經過酶化作用轉換成伯醇，經由丙醛轉化成相應的脂肪酸，轉化產物進入三羧酸循環并分解成CO2和H2O，或進入其他轉換過程[16-17]。環烷烴通過還原反應可形成烯烴，烯烴通過進一步脫氫作用形成伯醇和丙醛，兩者相互作用形成脂肪酸；或者由過氧化作用直接轉化成脂肪酸。一些微生物還可以通過氧化作用形成伯醇，并進一步氧化分解。同時，部分微生物通過脫氫作用成為不飽和脂肪酸，并形成某些脂肪酸帶有末端氫鍵，該類烴化脂肪酸降解能力強。土壤退化中后期細菌的生長情況見圖1、2。

圖1 土壤退化中期細菌生長情況Fig.1 Bacteria growth in the mid-degradation of soil

圖2 土壤退化后期細菌生長情況Fig.2 Bacteria growth in the late stage of soil degradation

環烷烴屬于難降解烴類。環烷烴的端部沒有氫鍵，其生化原理與烷烴端部氫化原理相似，并通過氧化酶氧化功能生成烷醇，然后脫氫為酮并進一步氧化成內酯或者直接轉化為脂肪酸[18-20]。笨和短鏈烷基被脫氫酶和氧化還原酶代謝成為鄰苯二酚和甲基二酚，后者可以在鄰位或者間位斷裂形成羧酸。

多環芳烴(PAHs)的降解首先由微生物產生的氧化酶進行，產物相互作用進行定位氧化。環氧化物由真菌被單加酶氧化所形成，再加入H2O產生醇和醛，將氧原子加到2個末端的苯環上，生化為過氧化物。通過物質之間相互反應形成的代謝產物，一方面可被生物合成用于微生物成分，另一方面可氧化成碳水化合物[21-22]。

2 油污土壤微生物修復影響因素分析

2.1微生物種類和菌群特性微生物不僅是石油降解的執行者，而且是微生物修復的核心力量，研究表明，混合菌株降解石油的效果明顯高于單獨菌株。Hamme等[23]通過混合菌株培養試驗，結果表明，混合培養菌株可明顯提高油脂的降解率；魏偉[24]通過設置不同復合鹽濃度篩選微生物混合菌株，結果表明，混合培養的菌株可明顯增加石油降解效果；于齊等[25]采集陜北典型石油污染土壤，施入19種常見城市綠化樹木枯落葉粉碎樣，進行混合分解培養試驗，并以主要成分層次分析法進行綜合評價。

2.2表面活性劑在石油烴的生物降解期間，烴的溶解度直接影響微生物降解速率。當濃度極低時，碳氫化合物是可溶的，但大部分溢出來的油脂遠大于其溶解限度，通過在微生物表面加入化學合成的表面活化劑可解決上述問題。微生物表面活化劑具有易降解、毒害低、對周圍環境超強適應性等特點成為材料化學和分子物理研究的熱點。微生物表面結構特性不同會產生不同結構的表面活化劑，主要是磷脂、脂質、脂肪酸和中性脂肪酸等。研究表明，微生物表面活化劑對石油烴類有明顯降解作用。

2.3系統環境由于石油構造成分復雜，因此微生物對油脂降解能力不盡相同，環境因素對石油烴類降解具有影響，這種影響通常對石油降解起關鍵作用。石油碳氫化合物可以在環境中長時間存在，而在另一個環境中，相同的碳氫化合物可以在數天或者數小時內完全降解。①土壤pH。像大多數微生物一樣，能夠降解石油物質的土壤微生物pH為6.0～8.0，優選7.0～7.5。在微生物降解過程中，由于長期影響產生的酸性物質在土壤中積累，導致土壤pH逐漸下降，引起土壤酸化，在被污染的酸性土壤中，為了增強微生物活化性能和提高石油烴類降解速率，一些農業酸堿緩沖劑可添加到土壤中，調節土壤的酸堿性。因此，土壤最適pH與降解菌種和降解環境有關。②土壤溫度。土壤溫度通過影響石油的物理性質和化學組成影響微生物的碳氫化合物代謝率。在溫度較低的環境下，隨著油黏度增加，烷烴末端有毒的短鏈作用揮發減弱，且烷烴水溶性加大，對微生物的毒性也增加，這將間接影響碳氫化合物的生物降解率，當溫度降低時，酶活性降低，導致降解速率降低。較高的溫度可以使碳氫化合物的代謝率最大化，通常為30～40 ℃。③供氧狀況。環境中的氧氣是微生物極其重要的限制因素，石油的微生物降解過程因碳氫化合物而異，但好氧微生物降解的初始反應類似，在微生物降解過程中，需要尋找大量的帶電粒子，主要溶解土壤的含氧量和負離子，由于油脂會在表面形成一層油膜，降低氧氣在土壤中的傳遞速率，在石油污染區，供氧不足已成為制約土壤中石油降解的主要因素。④土壤中營養成分。微生物的生長環境離不開必要的無機因素，但土壤環境提供的營養成分是有限的，石油中的烴類可以提供土壤必要的有機物，但不能提供氮、磷、硫、鎂等無機元素，因此該類無機養料是限制微生物活性的重要因素。為了降低土壤中的石油含量，提高土壤油脂降解率，需要在土壤中適當添加營養成分，促進石油烴類生物降解。⑤鹽濃度。低濃度的鹽類(NaCl、KCl、MgSO4等)對土壤中微生物生長具有促進作用，但濃度過高時，會抑制微生物生長，同時溶液中NaCl濃度對細胞膜上的Na+、K+泵有很大影響，而Na+、K+泵維持的細胞內外離子梯度具有重要的生理學意義，它不僅維持細胞的膜電位，也調節細胞的體積和驅動某些細胞中糖與氨基酸的運輸，從而影響細胞的生長。

3 不同條件對混合菌劑降解率的影響

3.1培養時間根據1∶1混合培養的2種菌劑，每100 mL篩選培養基0.5 mL，在30 ℃、110 r/min下振蕩培養，分別在培養后第2、3、4、5、6和7天測定，計算每種混合菌劑的油污降解率。從圖3可以看出，混合菌劑1#在培養初期的降解率非常低，第2天降解率為28.10%，混合菌劑2#為32.89%；降解率從第3天開始明顯增加，第5天混合菌劑1#的降解率為59.73%，混合菌劑2#為73.31%。隨著培養時間的延長，2種混合微生物菌劑對石油的降解速率逐漸變慢。第7天，混合菌劑1#對油污的降解率為70.10%，混合菌劑2#的降解率為81.23%。這說明隨著培養時間的延長，油脂去除率越高，去除效果越好，在設定的培養條件下，混合菌劑2#石油降解率顯著高于混合菌劑1#。因此，采用7 d為適宜的培養時間。

3.2培養溫度根據1∶1混合培養的2種菌劑，每100 mL篩選培養基0.5 mL，分別置于溫度15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下100 r/min密閉培養，經過7 d振蕩培養后，測量培養基中油脂含量，并計算每種溫度培養下石油的降解率。從圖4可以看出，培養溫度對混合菌劑2#的影響遠大于混合菌劑1#。在溫度15 ℃培養7 d后，混合菌劑1#石油降解率為32.59%，混合菌劑2#石油降解率為24.19%，在該溫度條件下，混合菌劑1#石油降解率顯著高于混合菌劑2#。當培養溫度繼續升高時，混合菌劑2#的降解速率呈線性增加，而混合菌劑1#的降解速率增加緩慢。當培養溫度設定為35 ℃時，混合菌劑1#對石油的降解率最大，隨著溫度繼續升高，降解率逐漸下降；當培養溫度設定為33 ℃時，混合菌劑2#對石油的降解率達到最大，降解率為78.69%，當溫度繼續升高，其降解率也隨之下降。這說明培養溫度對2組混合菌劑石油降解率均有影響，當培養時間7 d、菌劑接種量0.5 mL時，混合菌劑1#的最適培養溫度為35 ℃，混合培養菌劑2#最適培養溫度為33 ℃。

圖3 培養時間對不同混合菌劑降解率的影響Fig.3 Effect of culture time on degradation rate of different mixed bacteria

圖4 培養溫度對不同混合菌劑降解率的影響Fig.4 Effect of culture temperature on degradation rate of different mixed bacteria

3.3培養基pH設定混合菌劑培養基的pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0共9個水平。根據1∶1混合培養的2種菌劑，每100 mL篩選培養基0.5 mL，分別放置于溫度35 ℃條件下振蕩培養，將培養基放置7 d，并測定培養基中石油含量和混合菌劑對石油的降解率。從圖5可以看出，當初始pH為5.0～7.0時，混合菌劑1#石油降解率顯著高于混合菌劑2#，當初始pH為7.0～9.0時，混合菌劑2#石油降解率顯著高于混合菌劑2#，對于混合菌劑1#，在初始pH為5.0～7.5時，其降解率隨著初始pH的升高而升高，在初始pH為7.5時降解率達到最大值70.24%，之后隨著初始pH的升高，降解率呈直線下降趨勢；對于混合菌劑2#，在初始pH為5.0～8.0時，其降解率隨著初始pH的升高而升高，在初始pH為8.0時降解率達到最大值80.10%，之后隨著初始pH的升高，降解率呈明顯下降趨勢。這說明培養基pH不同對2組混合菌劑石油降解率有較大影響，當培養時間為7 d，菌劑接種量為0.5 mL，混合培養菌劑的最適培養溫度為35 ℃時，混合菌劑1#的最適初始pH為7.5，而混合菌劑2#的最適初始pH為8.0。

圖5 pH對不同混合菌劑降解率的影響Fig.5 Effect of pH on degradation rate of mixed bacteria

4 結論

(1)相比傳統物理、化學修復方法，微生物具有成本低、繁殖快、污染物完全氧化等特點，因此使用微生物改良污染的石油土壤，通過改變微生物在油污土壤的外界溫度、濕度、鹽分、氧氣含量和表面活性劑，同時接種高效的降解菌株，強化微生物修復能力，以此提高菌種在土壤中石油的降解速率。

(2)微生物的種類和菌群對土壤中石油降解具有重要影響，研究表明，混合培養菌的石油降解效果明顯高于單株培養菌，為混合培養菌添加表面活性劑，可提高石油降解效率，顯著改善土壤中石油降解效果。微生物表面活化劑在石油降解過程中具有積極促進作用，通過對污染土壤進行處理，修復后土壤中石油污染物的降解率達88.63%。

(3)每組混合菌種設置不同的培養時間、培養溫度和pH，不同試驗條件對混合菌種的降解率均有影響。隨著培養時間的延長，對石油的去除率越高，且去除效果越好，采用7 d 為適宜的培養時間，最適宜培養溫度為35 ℃，當總接種量為0.5 mL時，混合菌劑最適pH為8.0。試驗結果顯示，微生物培養環境達到以上最適條件，混合菌劑對油污土壤的降解率最大。