食品中沙門氏菌檢測方法比較

程 浩

(安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌，主要寄生于人類和動物腸道傳染致病，可致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等[1]。由于沙門氏菌經(jīng)常存活于肉制品、蛋類、水產(chǎn)品中，故世界各國普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門氏菌。據(jù)統(tǒng)計，我國細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起，人一旦攝入含有大量沙門氏菌(106～107個/g)的動物性產(chǎn)品，就會引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素作用下發(fā)生食物中毒導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒，且沙門氏菌的傳播媒介眾多，肉、蛋以及食品從加工到出售的過程中都十分容易發(fā)生污染[2-3]，因此對沙門氏菌的檢驗事關(guān)重大。目前常用的檢測方法有傳統(tǒng)方法(如國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、FDA、AOAC、FSIS、ISO、加拿大官方食品微生物分析方法)、儀器檢測法(如VIDAS、BAX)、商品化生化鑒定系統(tǒng)(VITEK GNI+、API 20E)[4-5]。筆者分別采用國標(biāo)GB4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法檢測食品中的沙門氏菌，比較3種檢測方法的檢測效果和檢出率。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗陽性菌種。腸炎沙門氏菌(CICC21513)來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2國標(biāo)GB4789.4—2016方法。緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)、亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、三糖鐵瓊脂(TSI)、XLD培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒、沙門氏菌O多價抗原、H多價抗原均來自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)。致病菌核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測儀、移液器、混勻器、恒溫金屬浴、高速離心機(jī)、迪澳沙門氏菌核酸檢測系列試劑盒均由廣州迪澳生物科技有限公司提供。

1.1.4MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡。快速檢測卡由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.2測試步驟

1.2.1國標(biāo)GB 4789.4—2016方法[6]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h，然后分別移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)，于42 ℃培養(yǎng)18～24 h；同時，另取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL 亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內(nèi)，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂(BS)、XLD培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基上，于(36±1)℃分別培養(yǎng)18～24 h或40～48 h(BS)；觀察在各培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，如發(fā)現(xiàn)疑似菌，純化后做生理生化鑒定。

1.2.2基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)[7-8]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h得增菌液。用快速提取試劑盒提取增菌液中沙門氏菌的核酸，將處理液滴加于檢測試劑中混勻，使用迪澳恒溫PCR檢測儀進(jìn)行檢測，自動判讀結(jié)果。

1.2.3MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡[9]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h得增菌液。移取1 mL增菌液到無菌試管中，于沸水中加熱10 min，冷卻后使用。打開檢測卡，在加樣孔中垂直滴加3～4滴(約100 μL)已滅菌的待檢樣品，等待8～10 min后，觀察檢測卡中部的檢視窗的結(jié)果。30 min后顯示結(jié)果無效。陽性反應(yīng)：C、T線均顯色。陰性反應(yīng)：C線顯色，T線不顯色。失效反應(yīng)：C線不顯色，測試失敗或檢測卡失效。

2 結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)檢測方法檢測結(jié)果檢測的63份食品樣品中，通過傳統(tǒng)國際GB4789.4—2016方法檢測，共檢出陽性樣品2份。2份樣品經(jīng)前增菌、増菌、分離純化后的菌種在培養(yǎng)基上的形態(tài)符合沙門氏菌，其生理生化試驗以及血清凝集試驗均滿足沙門氏菌的性狀，判定檢測結(jié)果陽性。

2.2快速檢測方法結(jié)果基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法都檢出了3份陽性樣品。

2.3檢測結(jié)果的比較從表1可看出，檢測的63份食品樣品中，用傳統(tǒng)國標(biāo)GB 4789.4—2016方法檢出2份陽性樣品，檢出率3.2%；而基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法均檢出了3份陽性樣品，檢出率均為4.8%。由此可見，基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統(tǒng)國標(biāo)方法相比較具有較高的靈敏性和特異性。

表1 3種檢測方法檢測結(jié)果比較

2.4檢測方法優(yōu)缺點比較從表2可以看出，3種檢測方法各有優(yōu)缺點，基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統(tǒng)國標(biāo)方法相比較具有操作方便、快速靈敏的優(yōu)點，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測和初篩；而國標(biāo)GB 4789.4—2016方法在國際上被廣泛承認(rèn)，是鑒定沙門氏菌的基準(zhǔn)方法。

表2 3種檢測方法優(yōu)缺點比較

2.5對于國標(biāo)中沙門氏菌檢測過程的思考

(1)前增菌和二次增菌都是必不可少的過程。食品中的沙門氏菌含量一般都很少并且會有多種細(xì)菌同時存在的情況，前增菌可以使受傷菌得到修復(fù)而增菌可以抑制一些雜菌的生長，所以用前增菌和增菌分別進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，可以增加后期分離培養(yǎng)的檢出率。

(2)分離培養(yǎng)中應(yīng)注意當(dāng)不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時，按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落：①HE和XLD。非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(jīng)(24±2)h培養(yǎng)后，沒有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。②BS瓊脂。某些非典型菌株產(chǎn)生綠色菌落，其周圍培養(yǎng)基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(yǎng)(24±2)h后，沒有出現(xiàn)典型菌落，則不挑取任何菌落讓平板繼續(xù)培養(yǎng)(24±2)h。如果經(jīng)(48±2)h培養(yǎng)后，仍沒有典型或可疑菌落出現(xiàn)，則挑取2個或更多個非典型的菌落。

(3)TSI要制備成高柱斜面，有助于結(jié)果判讀，試驗時應(yīng)先劃線再穿刺，先穿刺再劃線會由于含菌量太高，如果產(chǎn)H2S變黑，難以觀察底層的產(chǎn)酸現(xiàn)象，并且如果產(chǎn)氣較多的話培養(yǎng)基會被頂出很高更有甚者可能會頂開試管塞。典型沙門氏菌在TSI上斜面呈紅色，底端呈黃色，有氣體產(chǎn)生，90%形成H2S，瓊脂變黑。但對于乳糖陽性的沙門氏菌斜面也呈黃色，因此不能僅僅根據(jù)三糖鐵培養(yǎng)的結(jié)果就確認(rèn)沙門氏菌。

(4)目前沒有一種培養(yǎng)基能準(zhǔn)確無誤地篩選出沙門氏菌，因此必須選擇多種選擇性培養(yǎng)基同時進(jìn)行篩選，顯色培養(yǎng)基只是綜合選擇性更強(qiáng)，試驗人員不能只在選擇性培養(yǎng)基和TSI 特征符合而沒有把關(guān)鍵的生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定完成的情況下就報結(jié)果，這樣很可能導(dǎo)致結(jié)果假陽性。

(5)血清學(xué)鑒定是沙門氏菌檢驗中的重要鑒定方法，包括菌體抗原(O)鑒定、鞭毛抗原(H)鑒定和Vi抗原鑒定。血清檢測時要使用24 h內(nèi)的純菌，在規(guī)定時間內(nèi)觀察結(jié)果，并做自凝試驗。凝集不好的室溫(不要放冰箱)放置1～2 d或者傳代一次再凝集，可能凝集的情況會好些。如果實驗室條件許可建議購置進(jìn)口血清(以泰國和丹麥血清為佳)，如果用國產(chǎn)血清盡量同時使用2種廠家產(chǎn)品互相驗證。

(6)沙門氏菌結(jié)果判定應(yīng)該以生化試驗結(jié)果為主，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)判定。直接用多價血清進(jìn)行試驗而不進(jìn)行生化試驗是絕對不可取的。因為血清學(xué)的原理是抗原抗體結(jié)合，非沙門氏菌的微生物也有可能帶有沙門的類似抗原，這樣的操作可能會導(dǎo)致假陽性，因此在做鑒定時必須先進(jìn)行生化試驗，再在生化試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

(7)如果只需要鑒定某個菌株是否屬于沙門氏菌，那只需要做O多價和H多價血清就可以了(大多數(shù)食源性沙門氏菌凝集A-F群O多價)。如果要鑒定某個菌株具體是什么沙門氏菌，那就需要進(jìn)行血清學(xué)分型試驗，從多價血清一直做到O抗原和H抗原的單因子，然后參照《GB 4789.4—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》附錄B的表格查找對應(yīng)的沙門氏菌名。

(8)在做血清學(xué)鑒定時，O多價血清如果沒有凝集并不能直接判定為陰性，因為還要考慮Vi抗原的影響。Vi抗原屬于K抗原群會阻隔O抗原和相應(yīng)抗體的結(jié)合，所以當(dāng)Vi抗原存在時，O多價血清是不會凝集的，因此必須去除Vi抗原的影響。具體方法是挑取菌苔于1 mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查如果還是不凝集，才能判定為陰性。

3 結(jié)論與討論

該研究分別采用國標(biāo)GB 4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法檢測食品中的沙門氏菌，比較3種檢測方法的檢測效果和檢出率。結(jié)果顯示，檢測的63份食品樣品中，用國標(biāo)GB 4789.4—2016方法檢出2份陽性樣品，檢出率3.2%，檢測時間至少為6 d；而基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法均檢出了3份陽性樣品，檢出率均為4.8%，并且可以在30 h內(nèi)出結(jié)果。從靈敏度和特異性角度來看，基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法與傳統(tǒng)國標(biāo)方法相比較具有快速靈敏的優(yōu)點；從檢測周期來看，國標(biāo)GB 4789.4—2016微生物培養(yǎng)法中培養(yǎng)時間較長，最短的檢測周期為6 d，而基于迪澳生物核酸恒溫擴(kuò)增熒光檢測技術(shù)的致病菌快速檢測系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測卡的方法2 d即可出結(jié)果，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測和初篩，也可以作為國標(biāo)方法的有效補(bǔ)充。