一例禽腺病毒感染的病例診斷

史榮華，顏彩霞，張建軍，任 丹，高 巍

(1.國藥集團揚州威克生物工程有限公司，江蘇揚州 225127；2.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，大多數能在健康雞、鴨、鵝等禽類體內存在且復制，一般呈隱性感染[1]。禽腺病毒分為I 、II 和III 3個群，其中I 群禽腺病毒(FowlAdenovirus Group I，FAV-I)具有共同的群抗原，分為5個種、12個血清型[2]。世界各地均有報道，FAV急性感染主要表現為包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等癥狀[3]。2018年4月山東某肉雞場發生的疑似禽腺病毒感染雞群，臨床表現為心包中有淡黃色清亮液體，肝臟腫大，表面有出血點，經實驗室病毒分離與鑒定為血清4型禽腺病毒感染。

1 材料與方法

1.1病料采集病料來源于山東省某雞場，34日齡AA肉雞，剖檢疑似禽腺病毒感染，無菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等病料組織用于病毒分離以及組織病理學觀察。

1.2試驗材料SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，由國藥集團揚州威克生物工程有限公司實驗室孵化及飼養。

DNA提取純化試劑盒購自上海凱杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通瓊脂糖凝膠購自北京金式金生物技術有限公司，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，根據GenBank中I群禽腺病毒的Hexom基因序列保守區，設計合成引物，F：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；R：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其他試劑均為國產試劑。

1.3病毒分離采集病雞肝、脾、腎等病變組織，按1∶5 加入含適當濃度抗生素的滅菌PBS緩沖液，充分研磨，反復凍融3次后，離心取上清[4]，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，卵黃囊接種5個7日胚齡的SPF雞胚，置37 ℃溫箱孵育。每12 h照胚1次，將24 h內死亡雞胚棄去，24 h后死亡雞胚收取尿囊液并觀察胚體是否病變，7 d后存活的雞胚，置4 ℃凍死，收取尿囊液并觀察胚體是否病變。

1.4血凝試驗取30 μL收集的尿囊液用生理鹽水在血凝板中先進行倍比稀釋211，隨后每孔加入30 μL 1%雞紅細胞；置37 ℃反應10 min。若樣品孔出現雞紅細胞凝集現象，則判定為有血凝性；反之則為血凝陰性。

1.5PCR檢測用DNA提取試劑盒抽提雞胚尿囊液中的DNA，置-20 ℃備用。以提取的病毒DNA作為模板進行PCR擴增。反應體系為：DNA模板2.0 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳處理后，置于凝膠成像系統中拍照鑒定，陽性樣品送南京金斯瑞物科技有限公司進行序列測定，并將測定序列與GenBank上已發表FAdV核苷酸序列進行同源性比對。

1.6病理組織學檢測取病死雞的肝臟等組織用福爾馬林固定，按文獻方法[5]制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，染色后進行組織病理學診斷。

2 結果與分析

2.1病雞剖檢癥狀對現場病死雞進行剖檢發現，主要表現為肝臟表面有大量出血點和出血斑(圖1A)，包心，內含黃色積液(圖1B)。

圖1 病死雞組織病變Fig.1 Pathological changes of dead chicken

2.2病毒分離SPF雞胚在接種病料后，96 h內死亡2個，120 h內死亡2個，血凝試驗結果表明收獲的尿囊液沒有血凝性，排除了流感和新城疫病毒的感染。接種病料死亡的雞胚出現明顯的病變，主要表現為胚體出血，肝臟呈黃色，有明顯的出血點(圖2)。

圖2 接種雞胚病變Fig.2 Pathological changes of inoculated chicken embryo

2.3PCR鑒定和序列分析PCR產物經l%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出的目的條帶與預期設定的腺病毒陽性對照的條帶相符，大小約為500 bp(圖3)。測序結果表明，此病毒分離株的基因序列與Genbank已發表4型FAdV序列同源性達99%，從而確定為血清4型FAdV。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.腺病毒陽性對照；2.病毒DNA的PCR擴增產物Note：M.DL2000 DNA Marker；1.Adenovirus positive control；2.PCR amplification products of virus DNA圖3 PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification results

2.4組織病理學檢測組織病理學顯示：肝細胞明顯減少，大量肝細胞變性、壞死(圖4A)；肝細胞內可見嗜堿性包涵體(圖4B)。

圖4 肝臟病理變化Fig.4 Pathological changes of liver

3 結論與討論

FAdV-I 主要侵害3-8 周齡的肉雞，病死率最高可達80%。FAdV 既可通過種蛋垂直傳播又可通過病雞水平傳播[6]。I群禽腺病毒分為12個血清型，其中在白羽肉雞上4型和8b型禽腺病毒流行最為廣泛，4型主要表現為心包積水綜合征，而8b型則主要表現為包涵體肝炎[7]一些免疫抑制病，如傳染性法氏囊病和傳染性貧血病等混合感染會加劇家禽的發病和死亡[8]。2014—2016 年該病在我國發病范圍廣泛，給養禽業造成了巨大損失。

該試驗從山東省某肉雞場采集病料，根據臨床解剖病變，病毒分離、血凝試驗、PCR擴增及其產物序列分析、病理組織學分析，最終確診該病例為禽4型腺病毒感染。針對此種腺病毒感染一方面疫苗預防是有效的方法，另一方面做好環境的消毒工作，減少病原的傳播。一旦雞群發病無特效藥物，可增加營養和改善環境以增強體質提高抗病能力，同時添加適量抗生素防止繼發感染。死亡率逐漸增大的雞群可以緊急注射特異性高免血清或卵黃抗體。因該病目前無明確的致病機理，建議使用疫苗進行防控，選擇合適血清型滅活疫苗給健康雞群進行免疫預防，能達到90% 以上的保護效果。其中在肉雞上，5～7 日齡和21 日齡左右進行滅活疫苗的接種，可很好控制該病的發生。該雞場發病后選擇緊急注射腺病毒卵黃抗體并適當添加抗生素進行治療，加強雞舍通風消毒，死亡率下降顯著，7 d后雞群穩定，幾乎未見死亡病雞。