一例禽腺病毒感染的病例診斷

史榮華，顏彩霞，張建軍，任 丹，高 巍

(1.國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司，江蘇揚(yáng)州 225127；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，大多數(shù)能在健康雞、鴨、鵝等禽類(lèi)體內(nèi)存在且復(fù)制，一般呈隱性感染[1]。禽腺病毒分為I 、II 和III 3個(gè)群，其中I 群禽腺病毒(FowlAdenovirus Group I，F(xiàn)AV-I)具有共同的群抗原，分為5個(gè)種、12個(gè)血清型[2]。世界各地均有報(bào)道，F(xiàn)AV急性感染主要表現(xiàn)為包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等癥狀[3]。2018年4月山東某肉雞場(chǎng)發(fā)生的疑似禽腺病毒感染雞群，臨床表現(xiàn)為心包中有淡黃色清亮液體，肝臟腫大，表面有出血點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病毒分離與鑒定為血清4型禽腺病毒感染。

1 材料與方法

1.1病料采集病料來(lái)源于山東省某雞場(chǎng)，34日齡AA肉雞，剖檢疑似禽腺病毒感染，無(wú)菌采集具有典型病變的肝、脾、腎等病料組織用于病毒分離以及組織病理學(xué)觀察。

1.2試驗(yàn)材料SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，由國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室孵化及飼養(yǎng)。

DNA提取純化試劑盒購(gòu)自上海凱杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通瓊脂糖凝膠購(gòu)自北京金式金生物技術(shù)有限公司，DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，根據(jù)GenBank中I群禽腺病毒的Hexom基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)合成引物，F(xiàn)：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；R：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3病毒分離采集病雞肝、脾、腎等病變組織，按1∶5 加入含適當(dāng)濃度抗生素的滅菌PBS緩沖液，充分研磨，反復(fù)凍融3次后，離心取上清[4]，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，卵黃囊接種5個(gè)7日胚齡的SPF雞胚，置37 ℃溫箱孵育。每12 h照胚1次，將24 h內(nèi)死亡雞胚棄去，24 h后死亡雞胚收取尿囊液并觀察胚體是否病變，7 d后存活的雞胚，置4 ℃凍死，收取尿囊液并觀察胚體是否病變。

1.4血凝試驗(yàn)取30 μL收集的尿囊液用生理鹽水在血凝板中先進(jìn)行倍比稀釋211，隨后每孔加入30 μL 1%雞紅細(xì)胞；置37 ℃反應(yīng)10 min。若樣品孔出現(xiàn)雞紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，則判定為有血凝性；反之則為血凝陰性。

1.5PCR檢測(cè)用DNA提取試劑盒抽提雞胚尿囊液中的DNA，置-20 ℃?zhèn)溆谩Ｒ蕴崛〉牟《綝NA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：DNA模板2.0 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳處理后，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照鑒定，陽(yáng)性樣品送南京金斯瑞物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)定序列與GenBank上已發(fā)表FAdV核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6病理組織學(xué)檢測(cè)取病死雞的肝臟等組織用福爾馬林固定，按文獻(xiàn)方法[5]制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，染色后進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。

2 結(jié)果與分析

2.1病雞剖檢癥狀對(duì)現(xiàn)場(chǎng)病死雞進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，主要表現(xiàn)為肝臟表面有大量出血點(diǎn)和出血斑(圖1A)，包心，內(nèi)含黃色積液(圖1B)。

圖1 病死雞組織病變Fig.1 Pathological changes of dead chicken

2.2病毒分離SPF雞胚在接種病料后，96 h內(nèi)死亡2個(gè)，120 h內(nèi)死亡2個(gè)，血凝試驗(yàn)結(jié)果表明收獲的尿囊液沒(méi)有血凝性，排除了流感和新城疫病毒的感染。接種病料死亡的雞胚出現(xiàn)明顯的病變，主要表現(xiàn)為胚體出血，肝臟呈黃色，有明顯的出血點(diǎn)(圖2)。

圖2 接種雞胚病變Fig.2 Pathological changes of inoculated chicken embryo

2.3PCR鑒定和序列分析PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出的目的條帶與預(yù)期設(shè)定的腺病毒陽(yáng)性對(duì)照的條帶相符，大小約為500 bp(圖3)。測(cè)序結(jié)果表明，此病毒分離株的基因序列與Genbank已發(fā)表4型FAdV序列同源性達(dá)99%，從而確定為血清4型FAdV。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.腺病毒陽(yáng)性對(duì)照；2.病毒DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Note：M.DL2000 DNA Marker；1.Adenovirus positive control；2.PCR amplification products of virus DNA圖3 PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results

2.4組織病理學(xué)檢測(cè)組織病理學(xué)顯示：肝細(xì)胞明顯減少，大量肝細(xì)胞變性、壞死(圖4A)；肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)嗜堿性包涵體(圖4B)。

圖4 肝臟病理變化Fig.4 Pathological changes of liver

3 結(jié)論與討論

FAdV-I 主要侵害3-8 周齡的肉雞，病死率最高可達(dá)80%。FAdV 既可通過(guò)種蛋垂直傳播又可通過(guò)病雞水平傳播[6]。I群禽腺病毒分為12個(gè)血清型，其中在白羽肉雞上4型和8b型禽腺病毒流行最為廣泛，4型主要表現(xiàn)為心包積水綜合征，而8b型則主要表現(xiàn)為包涵體肝炎[7]一些免疫抑制病，如傳染性法氏囊病和傳染性貧血病等混合感染會(huì)加劇家禽的發(fā)病和死亡[8]。2014—2016 年該病在我國(guó)發(fā)病范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。

該試驗(yàn)從山東省某肉雞場(chǎng)采集病料，根據(jù)臨床解剖病變，病毒分離、血凝試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物序列分析、病理組織學(xué)分析，最終確診該病例為禽4型腺病毒感染。針對(duì)此種腺病毒感染一方面疫苗預(yù)防是有效的方法，另一方面做好環(huán)境的消毒工作，減少病原的傳播。一旦雞群發(fā)病無(wú)特效藥物，可增加營(yíng)養(yǎng)和改善環(huán)境以增強(qiáng)體質(zhì)提高抗病能力，同時(shí)添加適量抗生素防止繼發(fā)感染。死亡率逐漸增大的雞群可以緊急注射特異性高免血清或卵黃抗體。因該病目前無(wú)明確的致病機(jī)理，建議使用疫苗進(jìn)行防控，選擇合適血清型滅活疫苗給健康雞群進(jìn)行免疫預(yù)防，能達(dá)到90% 以上的保護(hù)效果。其中在肉雞上，5～7 日齡和21 日齡左右進(jìn)行滅活疫苗的接種，可很好控制該病的發(fā)生。該雞場(chǎng)發(fā)病后選擇緊急注射腺病毒卵黃抗體并適當(dāng)添加抗生素進(jìn)行治療，加強(qiáng)雞舍通風(fēng)消毒，死亡率下降顯著，7 d后雞群穩(wěn)定，幾乎未見(jiàn)死亡病雞。