普通PCR檢測方法在西藏地區鼠疫疫情判定中的應用

格桑曲珍 索朗德吉 占堆

【摘 要】

目的：了解聚合酶鏈反應（PCR）檢測方法在鼠疫疫情判定中的應用。方法：通過檢測鼠疫耶爾森菌一個特異的目的基因（F1抗原基因、pla基因）檢測鼠疫耶爾森菌。結果：2只病死旱獺臟器組織經PCR檢測，均呈現兩條與預期分子量相吻合的清晰目的擴增帶。與膠體金、反相血凝試驗（堆龍材料1：320、城關區材料1：5120）陽性完全相符。結論：PCR檢測方法具有快速、特異、敏感的特點，在基層，偏遠地區大力推廣，對及時、準確判定鼠疫疫情及處置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意義。

【關鍵詞】 普通PCR；鼠疫；疫情判定

Abstract Objective： understand the application of polymerase chain reaction （PCR） in the determination of plague outbreak.

Methods： a specific target gene （F1 antigen gene， PLA gene） was tested for yersinia pestis Results： PCR revealed two clear objective amplification bands that were consistent with the expected molecular weight. The results were consistent with the positive results of colloidal gold and reverse hemagglutination test （duilong material 1：320 and chengguan area material 1：5120）.

Conclusion： PCR detection method has the characteristics of quick， specific and sensitive. It is widely used in grassroots and remote areas， which is of great significance for timely and accurate judgment of plague outbreak and treatment of epidemic situation and prevention of epidemic spread.

【中圖分類號】R969.4 【文獻標志碼】

B 【文章編號】1005-0019（2018）14-011-01

鼠疫作為一種古老的疾病被世界衛生組織定為重新復燃的20種傳染病之一，目前其流行進入一個新的活躍期[1]。西藏自治區自1966年-2017年50多年期間共判定了52個縣為鼠疫自然疫源地，面積84.85萬平方公里，占全區總面積的70.7%，且近年來疫情呈上升趨勢，對人類健康造成嚴重威脅。然而我區目前主要應用傳統的“四步檢驗”方法，存在繁瑣、費時和受材料腐敗等諸多因素的影響，給疫情的及時、準確判定帶來了一定困難。通過對疫區鼠疫患者和疑似患者、流行區和非流行區鼠類、實驗感染動物和蚤等材料進行的現場檢測和實驗室研究，證明PCR檢測方法有高度的特異性和敏感性[2]。因此，2017年開始西藏地區逐步在鼠疫檢驗中推廣應用PCR方法，并成功判定了2起動物間鼠疫疫情。

1 材料與方法

1.1 被檢材料 采集于拉薩市堆龍德慶區德慶鄉和城關區奪底鄉2只病死旱獺臟器組織（心、肝、脾、肺）。

1.2 模板制備 取0.1g臟器研磨后取50ul上清液加入50ul無菌去離子水，倒入1.5ml微量離心管中，煮沸15min，離心10min（12000r/min），取上清液1-5ul進行PCR檢驗。

1.3 引物 選擇引物pla和F1基因片段，由上海輝睿生物科技有限公司合成供給。（生產批號：HR170420）.

1.4 PCR反應及擴增產物分析：試劑盒的鼠疫耶爾森菌為陽性對照，Rnase H2O為陰性對照，PCR-Marker為標準分子量，按試劑盒說明書配置反應體系進行PCR擴增及凝集電泳分析。

2 結果

2只病死旱獺臟器組織核酸提取后經PCR檢測，均呈現兩條與預期分子量相吻合的清晰目的擴增帶（F1：249bp；pla：456bp）。（圖1、圖2）。

3 結論

準確判定一起鼠疫疫情，最終依據鼠疫實驗室診斷結果。根據2008年9月新修訂的《中華人民共和國衛生行業標準WS279-2008鼠疫診斷標準》[2]，對未分離到鼠疫菌的疑似標本，除要求免疫學檢測陽性外，還要求基因檢測陽性，方可做出判斷[3]。經普通PCR檢測，2只病死旱獺基因擴增結果（圖1、圖2）與膠體金、反相血凝試驗（堆龍材料1：320、城關區材料1：5120）陽性完全相符，在6-8小時內成功判定了2起動物間鼠疫疫情，改變了以往只有分離到鼠疫菌才能確診的局面，為疫情處置爭取了第一時間。

以往西藏地區鼠疫疫情絕大多數發生在地廣人稀，交通不便的農牧區，呈散發和小流行，即使發生疫情，能通過傳統的“四步檢驗”方法，判定疫情并控制疫情的蔓延。如今西藏旅游業快速發展，資源開發利用，疫區人類活動頻繁，交通工具發達，人員流動大，為疫情的遠距離傳播創造了有利條件。西藏疫區面積大，發現病死旱獺尸體時，材料已經腐敗嚴重或只剩下殘體，再送到地市級疾控中心強毒室時，經常出現膠體金、反相血凝試驗結果陽性，卻檢不出鼠疫菌，“四步檢驗”方法無法及時準確判定疫情。

新的診斷標準出臺后，一起鼠疫疫情的判定不需要等1-2天的細菌培養結果，大大縮短了確診時間，而且非常特異、敏感，節約人力、物力及經費，是緊急情況下檢測鼠疫的有力手段。因此，PCR檢測方法在基層，偏遠地區大力推廣，對及時、準確判定鼠疫疫情及處置疫情，防止疫情蔓延具有重要的意義，從而保障人民群眾的生命財產安全。

參考文獻

[1] 頓珠，其加次仁，多吉格桑，等.加強鼠疫監測 嚴防人間鼠疫 確保邊疆穩定[J].西藏醫藥雜志，2013，34（04）：44-45.

[2] 石麗媛，郭英，張福新，等.應用PCR方法檢測鼠疫現場標本的研究[J].疾病預防控制通報，2013，28（2）：1-3.

[3] 中華人民共和國衛生部.WS279-2008 鼠疫診斷標準[S].北京：中國標準出版社，2008.

[4] 王鵬，張福新，郭英，等.云南省玉龍縣一起鼠間鼠疫的實驗室判定[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（8）：1105-1107.