EGFR和TREM—1在食管癌中的表達及黃芪多糖通過抑制炎癥因子輔助食管癌治療的作用研究

孫小虎 王璐 于洪 張文陸

【摘 要】

目的：探討表皮生長因子受體（EGFR）和髓系細胞觸發受體1（TREM-1）在食管癌（EC）組織中的表達及其與臨床病例特征之間的關系。方法：選取食管癌組織及癌旁組織各72例，采用SP免疫組化染色法檢測EGFR及TREM-1的表達，分析兩者與EC之間的臨床病理相關性。另選取食管癌患者術后給予APS注射液，測定APS對血生化指標的影響；采用ELISA法檢測炎癥因子IL-2，IL-6的含量。結果：食管癌組織中EGFR和TREM-1的陽性表達率高于癌旁組織，兩者呈正相關（P<0.05）。EGFR的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期相關，TREM-1的表達與淋巴結轉移相關。黃芪多糖治療可以改善EC手術患者生化指標，降低IL-2和IL-6的水平，與P-CT組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論：EGFR與TREM-1在EC組織中高表達，且EGFR與TREM-1兩者之間的表達呈正相關性。可作為食管癌預后判斷和基因治療的分子靶標。

【關鍵詞】 食管癌；表皮生長因子受體；髓系細胞觸發受體-1

【中圖分類號】R446.1 【文獻標志碼】

A 【文章編號】1005-0019（2018）14-003-01

Expression of EGFR and Trem-1 in Esophageal Carcinoma and the Inhibiting Role of APS in the Treatment of EC by Inflammatory Factors

SunXiaohu1，2，Wang Lu2， Yu HONG2，Zhang Wenlu1*

（1.Jinzhou Medical University，Liaoning，Jinzhou 121001；2.Liaoning Cancer Hospital，Liaoning，Shenyang 110042）

Abstract Objective： The aim of this study is to investigate the expression and clinical significance of EGFR （epidermal growth factor receptor） and TREM-1 （trigger receptor of myeloid cells -1） in esophageal carcinoma （EC）. Methods： The study tested 72 cases of EC tissues and 72 cases of para-carcinoma tissue. The expressions of EGFR and TREM-1 were detected by SP immuno-histochemical method.Then analyze the relationships and the correlations between these two antibodies and the clinical pathological factors of esophageal carcinoma. Moreover， APS were given to EC patients， then monitored the numerical value；Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was was used to test the numerical value of IL-2，IL-6.

Results： Compared with para-carcinoma tissue group， the expression of EGFR and Trem-1 were significantly increased in EC group，there was a positive correlation between the expression of the two （P<0.05）. The expression of EGFR was possitively correlated to depth of invasion，lymph node metastasis and clinical stages；the expression of TREM-1 was possitively correlated to depth of lymph node metastasis. Compared with normal control P-CT group， the level of IL-2 and IL-6 in APS group were decreased， and the biochemical criterion were significantly IMPROVed in APS group （P<0.05）.

Conclusions： The expression of TREM-1 and EGFR were significantly increased in EC and P-CT groups， and the expression of EGFR and TREM-1 were possitively related. ， and may be employed to indicate the biomarker of prognosis of esophageal carcinoma patients and regarded as a target of gene therapy.

Key words：esophageal carcinoma； epidemal growth factor receptor；triggering receptor expressed on myeloid cells-1

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一。我國EC的患病率近年呈逐年遞增趨勢，發病人群也逐漸呈年輕化趨勢[1，2]。手術治療仍是EC的首選治療手段，而晚期患者只能以延長生存時間及改善生存質量為主要治療目的[3-5]。髓系細胞觸發受體通過調節炎癥反應，進而影響多種腫瘤的發生、發展及預后[6]。表皮生長因子受體在多數人類腫瘤中也出現高表達。另外，白介素-2，白介素-6在腫瘤，特別是在EC中也表現出高表達的現象[7，8]。本研究檢測EGFR和TREM-1在EC組織及癌旁組織中的表達情況，探討EGFR與TREM-1的表達與食管癌的臨床病理特征的關系，為EC的診斷、治療及預后提供客觀的參考指標；檢測EC組織中炎癥因子IL-2，IL-6的含量，同時為EC的傳統中藥綜合療法提供臨床理論指導。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本 本研究隨機選取并整理了2016年3月至2017年6月于遼寧省腫瘤醫院胸外科行手術切除并經病理證實為EC的患者共72例作為受試對象。所有病例經核實患者無重復，臨床病理資料完整。

1.1.2 試劑及耗材 兔抗人表皮生長因子（即用型）（GT209307）購自基因科技有限公司；兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（ab214202）購自英國Abcam公司；IL-2，IL-6酶聯免疫檢測試劑盒購自美國R&D; SYSTEMS公司；EDTA抗原修復液購自北京雷根生物技術有限公司；注射用黃芪多糖（伯恩）購自天津賽諾制藥有限公司。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機（LEICA-RM213）購自德國萊卡公司；臺式水浴恒溫振蕩器（TSHZ-A）購自上海躍進醫療器械廠；全自動化學發光免疫分析儀（SIEMENS Advia Centaur XP）購自德國西門子公司；Olympus光學顯微鏡（H-600）購自日本Olympus公司；德國生物信號顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和標本處理 本實驗共分為二組：疾病模型組（EC組）：選取EC患者共72例，經患者簽署知情同意書后，將受試患者的病理臘塊標本及其相關的臨床病理資料作為疾病模型組。癌旁組織組（P-CT組）：選取上述72例食EC患者的癌旁組織（食管癌邊緣外≥2cm），作為癌旁組織組。

上述受試患者的食管標本離體30min內進行處理。按照分組要求，切取面積約1.0cm×1.0cm的食管組織作為受試組織。取出的食管組織立即采用生理鹽水（Normal saline，NS）進行漂洗，放入10%甲醛當中進行固定，標本常規脫水、石蠟包埋，進行SP免疫組化，觀察病理改變。

1.2.2 SP免疫組化 高壓加熱沸騰 修復抗原，3%H：O：去離子水以阻斷內源性過氧化物酶活性，分別滴加兔抗人表皮生長因子（1：200）、兔抗TREM-1抗人單克隆抗體（1-200）（一抗），室溫孵育1h，滴加二抗，室溫孵育 30 min，PBS沖洗2 rain×3次，每張切片滴加DAB 顯色劑100 Ixl，室溫顯色，鏡下控制反應時間，PBS 洗滌，蘇木精復染，常規脫水，透明，中性樹膠封片。

1.2.3 結果判定 在雙盲條件下進行染色結果判定，每張組織切片在400倍光學鏡頭下隨機選取10個視野，依照細胞染色部位，染色密度及染色強度進行結果判定。細胞核及細胞質染色評分：染色面積評估：隨機選取10個視野，計數染色面積測定。0分：無陽性細胞；1分：≤25%；2分：26-50%；3分：51%-100%。染色強度評分：指多數陽性細胞呈現的染色特性：0分：無著色；1分：淡黃色；2 分：棕黃色；3 分：棕褐色。表達水平通過細胞染色比例及染色強度得分乘積判定。細胞膜評分：0分：無反應或少于10%的細胞膜染色；1分：≥10%的細胞膜出現微弱染色；2分：≥10%的細胞側膜、基底側膜或完全膜出現中度染色；3分：≥10%細胞強染色出現在側膜、基底膜或全部染色； 上述分數之和用來判斷Trem-1和EGFR結果，>2分者為陽性，≤2分者為陰性。

1.2.4 術后黃芪多糖治療 在本部分中另外選取經手術治療的食管癌患者20名及健康人10名作為受試對象，分為三組：空白對照組（N組）：10名健康人作為空白對照，不給予任何處理因素，只取血樣作為空白對照組。食管鱗癌術后模型組（EC組）：選取EC切除術后患者10名，術后給予常規處理，簽署知情同意書，入組。黃芪多糖治療組（APS組）：選取于我院行食管癌切除術治療的患者10名，術后予常規處理，給予APS注射液綜合治療，一次250mg，一日1次，用藥療程2周。

上述EC組及APS組受試對象，于術前及術后2周、N組于術前相同時間段分別采血，測定各組血清谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白及特異性腫瘤生長因子數值，并進行統計學分析。

上述EC組及APS組受試對象經APS治療2周后，采血，采用ELISA法測定炎癥因子IL-2及IL-6的含量。將標準品稀釋配制成相應濃度的標準品，加樣，配液，洗滌，顯色，終止反應。測定：用酶標儀于530nm處，測定各孔的吸光度值（OD值）；通過已知標準品的濃度及檢測出的標準品的OD值，計算各組檢測樣品的濃度。測定IL-2、IL-6的結果以nmol/mg 蛋白表示。以上實驗重復3次。

1.3 統計分析 采用SPSS17.0統計軟件對實驗所得數據進行統計學分析。所有實驗數據以均數±標準差（x-±s）表示。兩組間的數據比較，采用獨立樣本t檢驗；對計數資料行2 檢驗；多組數據間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR在食管癌及癌旁組織中表達 免疫組化顯示，EGFR的陽性表達表達在食管鱗癌組織中主要定位于細胞膜及細胞漿內；而在癌旁組織中弱表達于細胞膜上。陽性表達率分別為72.2及31.8%，兩者之間差異具有統計學意義（

2.2 TREM-1在食管癌及癌旁組織中的表達情況 免疫組化實驗結果顯示，TREM-1的陽性染色在EC組中主要定位于細胞核及細胞漿中，在P-CT組中弱表達于細胞膜中，陽性表達率分別為69.4%及32.7%。兩組間比較，差異具有統計學意義（2=11.514，P<0.001）（見圖2A、2B）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達與臨床病理特征的關系 對本實驗中EGFR和TREM-1在食管鱗癌中的的表達結果進行分析，EGFR的表達與年齡、性別、組織分化程度無相關性（P>0.05），與腫瘤的浸潤深度（P=0.004）、淋巴結轉移（P=0.001）、臨床分期（P=0.012）存在相關性（P<0.05）。TREM-1的表達與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小及TNM分期無相關性（P>0.05），在有、無淋巴結轉移的食管鱗癌組織中的陽性率分別為77.1%和54.1%，差異具有統計學意義（P<0.05）（見表1）。

2.3 EC中EGFR和TREM-1的表達的相關性 在72例EC患者的食管組織中，TREM-1和EGFR共同陽性表達例數為46例，共同陰性表達例數為16例，經X2 檢驗列聯系數分析，兩者之間的表達成正相關（r=0.520，P<0.001）（見表2）。

2.4 術后APS對各組的治療作用比較

2.4.1 APS對血生化等指標的影響 檢測與EC手術后治療情況密切相關的相關血生化等因子，包括TSGF、AST、TP和ALB。經過統計學分析，得出如下結果：ASP組及EC組（術前及術后2周）的血生化指標與N組相比，TSGF、AST值升高，TP和ALB值下降，結果差異顯著，具有統計學意義（P<0.05）；在ASP組中，經過ASP治療2周后的各個血生化指標與ASP治療前相比，TP和ALB值升高，TSGF和AST值下降，差異有統計學意義（P<0.05）。另外，術前對比術后2周的ASP組及EC組同組別之間的生化指標變化幅度，ASP組中TP和ALB值升高幅度及TSGF和AST值下降的幅度更明顯，存在顯著性差異，有統計學意義（P<0.05）（見表3）。

2.4.2 ASP對術后炎癥因子IL-2、IL-6的影響檢測EC術后應用ASP治療后炎性因子IL-2和IL-6的水平變化。ASP組患者的炎癥因子IL-2和IL-6水平與N空白組相近，無顯著性差異（P>0.05）。然而，將單純手術治療的EC組分別與N空白組和ASP治療組相比，炎性因子IL-2和IL-6均升高，差異具有統計學意義（P<0.05）（見表4）。

3 討論

食管癌（EC）是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來，EC除了患病率呈現逐年遞增趨勢，患者也逐漸呈現年輕化的趨勢。手術治療仍然是EC所采用的的首選治療手段，目前，傳統中藥逐漸應用到腫瘤的治療中，作為綜合治療手段，中藥越來越突顯出其治療的有效性。綜合治療對早、中、晚期的EC患者均有良好的治療作用[9，10]。

近年來的研究發現，TREM-1通過調節炎癥反應影響了食管癌的發生、發展及預后[11，12]；與其相似，EGFR也是一種跨膜的炎性蛋白。本實驗免疫組化結果顯示，在EC的SP染色的組織切片中，TREM-1陽性染色主要定位于細胞核及細胞漿中，EGFR陽性表達主要集中在細胞膜及細胞漿內；P-CT組中TREM-1和EGFR主要弱表達于細胞膜上，說明TREM-1和EGFR在EC中高表達，提示食管癌的發生、發展與TREM-1和EGFR密切相關。TREM-1和EGFR在EC中過度表達，且與腫瘤的TNM分期、是否存在淋巴結轉移以及浸潤深度存在相關性。這提示TREM-1和EGFR可能作為早期診斷EC的重要指標，可以為EC的臨床診斷起到一定的輔助作用。

通過本次實驗研究，我們還可以看出，EGFR與TREM-1在EC的表達中存在正相關性（r=0.520，P<0.05），提示兩者在EC的發生發展中存在某種協同作用。

在本試驗中，通過對EC手術切除腫瘤的患者給予傳統中藥黃芪多糖進行綜合治療，我們可以得知，與單純手術治療的EC患者相比，TSGF、AST值顯著下降且TP和ALB值升高。該結果提示，APS對EC手術患者有明顯的治療作用，降低患者術后的并發癥，改善患者的生活質量和生存時間。我們也可以發現，APS治療能明顯降低炎性因子IL-2及IL-6含量。因此，在EC的治療中，應采取手術治療合并中藥治療的綜合療法。中藥與手術治療相結合有諸多好處，手術前應用中藥扶正治療，可減少手術中的并發癥。手術后應用的中藥抗腫瘤治療，可以控制癌癥的發展，以扶正和驅邪相結合，對治療EC有良好的治療效果[13]。

綜上所述，本實驗結果證明了TREM-1和EGFR在CRC組織中的高表達，對結腸癌的的發生、發展起調節作用，為臨床防治CRC提供了重要的理論依據。同時，EC患者術后輔助以APS治療，能通過降低炎癥因子的表達，改善EC患者的血生化指標，對開展食管癌輔助治療具有重要的實踐意義。

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