雌激素抑制脂滴包被蛋白Perilipin 2減少肝細胞脂質沉積

李鳳娟 魏蘇寧 王綠婭 徐國恒

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)目前已成為我國慢性肝病的重要病因[1-2]。當女性絕經后，脂肪肝的發病率增高[1-2]。流行病學、臨床和動物實驗研究均揭示雌激素具有抵抗脂肪肝發生的作用。脂肪肝病理變化是肝實質細胞內脂滴 (lipid droplet)形成和儲積，近年來研究發現，脂滴包被蛋白Perilipin 2 (Plin2) 可以促進肝細胞內脂質的積累，在肝臟脂質代謝中具有重要的調節作用[3-4]。而雌激素是否通過影響Plin2而抑制脂肪肝發生尚未見報道。本文通過建立油酸誘導肝細胞脂肪變性模型，研究雌激素對脂滴包被蛋白Plin2的作用，旨在為為圍絕經期女性非酒精性脂肪肝防治提供新的實驗依據。

材料與方法

1.細胞系 人肝癌細胞HepG2細胞株購自于美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

2.主要試劑 DMEM高糖培養基購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自廈門星隆達化學試劑有限公司；油酸購自德國 Calbiochem 公司；尼羅紅染料購自美國Sigma公司；羊抗鼠 Plin 2 抗體由美國國立衛生研究院Constantine Londos 教授惠贈；兔抗 EIF5 抗體購自美國Santa Cruz公司。白蛋白結合的油酸制備：將2.8g不含脂肪酸的BSA溶于20 mL 100mmol/LTris-Cl(pH 8.0)中，向上述溶液中加入78 μL,37 ℃預熱的油酸液體；溶解后將其過濾除菌得到澄清的油酸儲存液(12.5 mmol/L)；油酸儲存液按1:31(v/v)用培養基稀釋即得到0.4 mmol/L油酸誘導工作液，可直接用來刺激細胞內TG蓄積。

3.油酸誘導肝細胞脂肪變性模型建立 HepG2 細胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基傳代培養。將 1cm x 1cm 的玻片放入 24 孔培養板，取對數生長期的 HepG2 細胞種植于 24 孔培養板，制作細胞爬片。細胞種植 24 h 后，加入終濃度為 0.4mmol/L油酸誘導工作液培養 48 h，誘導肝細胞脂肪變性，尼羅紅染色法進行染色[5]，鏡下觀察拍照(Eclipse 50i 型顯微鏡，日本 Nikon 公司)。

4.雌激素對肝細胞脂肪變性的影響 按上訴 “3”方法建立肝細胞脂肪變性模型，設置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+不同濃度雌激素(1 nmol、10 nmol、100 nmol 和 1 μmol)的實驗組，處理 48 h，尼羅紅染色法進行染色，鏡下觀察拍照。

5.Plin2 免疫熒光染色 建立肝細胞脂肪變性模型，設置 DMSO 對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實驗組，處理 48 h 后，進行 Plin2 免疫熒光染色，PBS 洗滌細胞 2 次，4%多聚甲醛室溫固定15min；PBS洗滌3次，加入透膜液(10% Triton X-100)室溫孵育10 min；PBS洗兩次后，加入封閉液封閉10 min；PBS洗1次，加入一抗稀釋液，4 ℃孵育16～18 min；PBS洗3次，二抗稀釋液孵育，室溫避光輕搖 1 h；移去二抗稀釋液，加入Hoechst染液復染核，室溫孵育10 min；PBS輕柔流洗3次，抗熒光淬滅封片劑封片，鏡下觀察拍照。

6.蛋白免疫印跡實驗 建立肝細胞脂肪變性模型，設置DMSO對照組、油酸模型組、油酸+雌激素(1μm)的實驗組，處理48 h后，PBS洗滌細胞2次。加入適量細胞裂解液，轉移到1.5 mL離心管置冰上，反復劇烈振蕩解裂解細胞，BCA法測定蛋白質含量。進行SDS-PAGE電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜上，用5%牛奶封閉液封閉30 min，加入一抗 Plin2(1∶1 000)和EIF5 單抗(1∶10 000)，4℃ 孵育過夜(EIF5 單抗室溫孵育60 min)，TBST緩沖液(0.05% Tween20 的 TBS 緩沖液)洗膜10 min ×3次，1∶5 000 稀釋 HRP 標記的二抗，室溫孵育 60 min，TBST緩沖液洗膜10 min ×3次，膠片發光，掃描分析。

7.統計學分析 使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行數據統計作圖。計量資料以均數±標準差表示，采用多法重復方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.油酸誘導肝細胞脂肪變性模型建立 HepG2 細胞經過油酸誘導后能夠很好的呈現出細胞內脂肪沉積的特征。細胞內的脂滴主要分布在細胞質靠近細胞膜的部位。尼羅紅染色可見脂滴呈高亮的橘紅色點狀或片狀分布，而不經油酸誘導的DMSO對照則不能生成任何脂滴，說明油酸誘導肝細胞脂肪變性模型建立成功。見圖1。

圖1 油酸誘導HepG2細胞脂肪變性的模型建立(×400) DMSO: 二甲基 亞砜; OA: 油酸(0.4 mmol)

2.雌激素減少油酸誘導的肝細胞脂肪變性 成功建立油酸誘導肝細胞脂肪變性模型后，在加入油酸的同時加入不同濃度的雌激素，觀察雌激素對肝細胞脂肪變性的影響。結果顯示雌激素能夠濃度依賴性的降低肝細胞內的脂肪變性，脂滴的數量逐漸減少，甚至消失。當雌激素濃度為1 μmol 時，抑制效果最為顯著。見圖2。

3.免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達的影響 利用已建立的油酸誘導肝細胞脂肪變性模型，在加入油酸的同時加入1 μm的雌激素，通過免疫熒光染色觀察雌激素對Plin2蛋白表達的影響。染色結果顯示，油酸處理能夠顯著性的增加Plin2的蛋白表達，綠色熒光信號增強，當加入雌激素后，能夠降低Plin2的蛋白表達水平，綠色熒光信號明顯減弱。見圖3。

圖2 雌激素減少油酸誘導的肝細胞脂肪變性(尼羅紅染色，×400倍) 注：DMSO:對照組、油酸模型組(OA：0.4mmol/L)、油酸+不同濃度雌激素(E2) 1 nm、10 nm、100 nm 和 1 μm 的實驗組。

4.蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達的影響 為了進一步明確雌激素對Plin2蛋白表達的影響，分別收取了DMSO對照組、油酸模型組和油酸加1 μm雌激素實驗組的細胞，進行了蛋白免疫印跡實驗。結果顯示Plin2的蛋白表達水平在油酸的誘導下顯著升高，加入雌激素后能夠抑制油酸誘導的Plin2的增加。DMSO對照組、油酸誘導模型組和雌激素實驗組Plin2蛋白表達相對光密度分別為0.409 ± 0.051、0.739 ± 0.060和0.438 ± 0.061，雌激素顯著性減少了油酸誘導的Plin2的蛋白表達水平(P<0.05，圖4)。

討 論

脂肪肝已經成為引起慢性肝病和心血管相關疾病的重要因素之一[6]。正常情況下肝臟內脂肪酸的獲取和輸出處于平衡狀態，當肝臟脂肪酸獲取增多而輸出受阻時便會引起脂肪肝[7]。目前有關雌激素抑制脂肪肝發生機制的研究主要集中在影響脂質合成和輸出兩個方面。

女性絕經后，卵巢停止產生雌激素，雌激素水平顯著降低，發生高血脂、胰島素抵抗、脂肪肝等癥狀[8-9]。絕經后女性患脂肪肝的概率增加，是絕經前女性的兩倍，給予絕經后女性進行雌激素替代治療后，其發生脂肪肝的概率明顯下降[10]。Lin 等發現，小鼠卵巢切除后脂質從頭合成的關鍵酶乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的表達明顯增加，肝臟內TG含量上升，而給予雌激素后ACC的表達下降，TG水平也降低，減少了脂肪肝的發生[11]。雌激素也可通過上調核轉錄因子PPARδ及其下游靶基因，促進脂肪酸的氧化，減少肝臟中脂質的積累[12]。由此可見，雌激素可以通過抑制脂質合成途徑或是促進脂質輸出途徑來減少肝臟內脂質的含量。

圖3 免疫熒光檢測雌激素對Plin2表達的影響 注：DMSO:對照組、油酸模型組(OA：0.4mmol/L)、油酸+雌激素(E2)1 μm 的實驗組，Plin2 免疫熒 光染色(綠色熒光信號),分別為(×200)和(×400)

圖4 蛋白免疫印跡檢測雌激素對Plin2蛋白表達的影響 注：A：蛋白免疫印跡實驗檢測在DMSO對照組、 油酸模型組和油酸+雌激素實驗組Plin2蛋白表達水平。B：Plin2相對于EIF5的光密度，注：* P<0.05

脂肪肝最基本的病理變化是肝實質細胞內脂滴的形成和儲積。近年來，脂滴包被蛋白(Perilipin)家族相繼被發現，它們在脂肪代謝過程中發揮重要作用，其中Plin2廣泛表達于各種組織。已有文獻報道Plin2可以促進細胞內脂質的積累。外源性過表達Plin2可以促進成纖維細胞內脂滴的形成和積累[13]；在肝臟細胞中過表達Plin2，TG含量也增多[14]。此外，Plin2基因敲除小鼠與正常小鼠相比，高脂飲食后，肝臟TG的水平下降約60%，并且能夠抵抗高脂飲食誘導的脂肪肝產生[15]。而本研究則發現雌激素能夠降低Plin2的蛋白表達水平，減少肝細胞內的脂質沉積。

綜上所述，本文成功建立油酸誘導肝細胞脂肪變性的模型，發現雌激素可能通過抑制Plin2的蛋白表達從而減少肝細胞內的脂質沉積。本文為圍絕經期女性非酒精性脂肪肝防治的研究奠定實驗基礎。