p42/p44促分裂素原活化蛋白激酶上調炎癥誘導的血管平滑肌細胞沉默調節(jié)蛋白1的表達

張慧娜 李 玉 彭 露 楊云云

沉默調節(jié)蛋白1(sirtuin 1, SIRT1)在許多生理病理過程如胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調節(jié)、抵御損傷等方面發(fā)揮重要作用[1]。作為多項生理功能的調解者， SIRT1的表達在不同狀態(tài)下也受到精細調控，如限制飲食和饑餓狀態(tài)、氧化應激及脂肪細胞的分化均能夠使SIRT1表達增高[2-4]。SIRT1的抗炎效應及其對心血管疾病的保護作用已有大量報道[5-7]，但炎癥對SIRT1表達的影響鮮有報道。我們前期發(fā)現(xiàn)NF-κB的大亞基p65參與了TNF-α對SIRT1的表達上調[8]。本研究擬檢測球囊損傷的大鼠頸總動脈及TNF-α處理的，大鼠血管平滑肌細胞中SIRT1的表達情況及促分裂素原活化蛋白激酶(mifogen-achvated protein kinases,MAPKs)信號通路，尤其是p42/p44 MAPK通路在其中所起的作用，探討了炎癥狀態(tài)對血管平滑肌SIRT1基因的表達影響及其相關信號通路。

材料與方法

1.動物及試劑 雄性，SD大鼠，體質量300g左右，共12只。由中國軍事醫(yī)學科學院動物中心提供；進口胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基為HyClone公司產(chǎn)品；TNF-α購自Peprotech公司；PD98095、α-SMA、anti-Actin和anti-α-p42/p44 MAPK及Phospho-anti-α-p42/p44 MAPK抗體購自Sigma Aldrich公司； anti-SIRT1抗體購自Abcam公司；HRP標記的IgG二抗購自Santa Cruz公司；ECL試劑盒購自威格拉斯公司；HRP-DAB檢測試劑盒、山羊血清購自北京中杉金橋公司。

2.動物分組及球囊損傷模型 將300g左右雄性，SD大鼠12只，每組4只，分為三組，分別是未作手術組，假平均組和球聲損傷組，假手術組進行麻醉、固定后鈍性分離左頸總動脈。球囊損傷模型組行麻醉固定后鈍性分離左頸動脈結扎頸總動脈遠心端，近心端用血管鉗暫時阻斷血流，用顯微外科剪在血管遠心端1/3處橫向剪一小口，逆行將球囊插入左頸總動脈近心端約2～2.5 cm，用空氣充盈球囊，緩慢來回抽動3次剝脫內膜。結扎左頸總動脈近心端并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，防止黏連。逐層縫合皮下組織與皮膚。術后注射青霉素20萬單位預防感染。喂食普通飼料，自由飲水。術后28d，取損傷部位的左頸總動脈約1.0cm，石蠟包埋后行病理切片，HE染色和免疫組化染色。

3.血管平滑肌細胞培養(yǎng) 將2～3只，體質量100～150g 麻醉、固定后，75%乙醇消毒，在體分離胸主動脈，去除血凝塊、血管外膜層及脂肪，剪開血管腔，去除血管內膜，放入盛有D-Hank’s液的細胞培養(yǎng)皿中，用手術刀片將血管切成1mm2的方塊并在2.5%胰酶消化液中消化1min后轉移入培養(yǎng)瓶，組織塊的間距為0.5cm，使貼組織塊的瓶底朝上培養(yǎng)4～5h后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中(10%胎牛血清的高糖DMEM)，繼續(xù)靜置3～5d，待有細胞從組織塊周圍游離出后換液。大部分組織塊長出細胞暈，并與相鄰細胞暈相接觸時傳代。

4.TNF-α處理大鼠主動脈血管平滑肌細胞 大鼠主動脈血管平滑肌細胞長到約80%滿，加入TNF-α(30ng/mL)刺激，8h后收獲細胞提取細胞總蛋白，或在收獲細胞總蛋白之前30min加入p42/p44 MAPK(ERK1/2)抑制劑PD98059 (20 μmol/L)，JNK抑制劑SP600125(10μmol/L)或p38 MAPK抑制劑SB202190(10 μmol/L)，Western blotting檢測SIRT1表達水平。

5.HE染色 石蠟切片用二甲苯進行兩次脫蠟后浸入100%到70%遞減的乙醇溶液中各1min，蒸餾水漂洗一次，蘇木素溶液染色5min，自來沖洗后入稀釋的鹽酸乙醇溶液中分色至核呈紫藍色，自來水返藍，蒸餾水洗去堿性水分，70%和80%乙醇各洗5min，入伊紅染液染色30s至數(shù)分鐘，以95%乙醇分色至胞漿、結締組織呈桃紅色。染色后的切片浸入從70%到100%遞升的乙醇溶液脫水，之后浸入二甲苯5min，將組織周圍多余的二甲苯拭去，滴中性樹膠后加蓋玻片封固。

6.免疫組化 石蠟切片用二甲苯脫行兩次脫蠟后浸入100%到70%遞減的乙醇溶液中各1min，PBS漂洗后浸入3% H2O2室溫孵育5～10min，再一次PBS漂洗后浸入pH 8.0的 EDTA中，高壓鍋121°C 處理10min以修復抗原，PBS漂洗三次后滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育1～2h，之后進行PBS漂洗并滴加相應的HRP標記的二抗，37℃孵育30min。PBS漂洗后用DAB顯色試劑盒顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復染核，梯度乙醇脫水，二甲苯處理, 以中性樹脂封片。熒光顯微鏡下觀察結果，拍照。

7.Western blotting 細胞加RIPA裂解液裂解，冰浴15～30 min。4℃，12 000 r/min離心15min。上清液即為細胞總蛋白。BCA法測定蛋白質濃度。將30μg細胞總蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，4℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗2h，ECL法檢測蛋白表達。

8.統(tǒng)計學處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差表示，計量資料間兩組均數(shù)比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 大鼠左頸總動脈球囊損傷導致SIRT1表達增加 A：SD雄性大鼠左頸總動脈球囊損傷28天后進行石蠟切片和HE染色(100×)；B：損傷組和對照組分別用α-SMC actin和anti-SIRT1抗體進行免疫組化染色(n=4) (400×)

結 果

1.球囊損傷的大鼠頸總動脈中SIRT1表達增加 在SD大鼠左頸總動脈球囊損傷模型中觀察到損傷第28天新生內膜層明顯增厚，管腔極度縮窄(圖1A)，用血管平滑肌的標志蛋白α-SMA作免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)新生內膜中有大量的血管平滑肌細胞(圖1B)。免疫組化的結果顯示球囊損傷模型組與對照組相比，SIRT1的表達明顯增高(圖1B)。

2.TNF-α促進大鼠血管平滑肌細胞中SIRT1表達 以往的研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷的頸總動脈模型中TNF-α等炎癥因子表達增高[9-10]。為了進一步明確炎癥損傷對SIRT1表達的影響，在細胞水平，我們檢測了TNF-α處理的原代血管平滑肌細胞中SIRT1的表達。免疫熒光結果顯示血管平滑肌細胞中SIRT1主要集中表達于細胞核，且30ng/mL TNF-α處理8小時后，血管平滑肌細胞SIRT1的表達增高(圖2)。

圖2 TNF-α 促進血管平滑肌中SIRT1表達 免疫熒光檢測TNF-α對血管平滑肌細胞內源性SIRT1表達的影響。30ng/mL TNF-α處理原代血管平滑肌細胞8h后，用SIRT1一抗和FITC(綠色)標記的二抗孵育。 DAPI(藍色)用于細胞核染色(×20μm)

圖3 p42/p44 MAPK參與血管平滑肌細胞中TNF-α誘導的SIRT表達 A：TNF-α促進血管平滴滑肌細胞SIRT1和磷酸化p42/p44 MAPK蛋白表達；B：PD98059 (20 μM)，JNK抑制劑SP600125(10μM)或p38抑制劑SB202190(10μM)預處理血管平滑肌細胞30min TNF-α誘導的SIRT1表達被MAPK抑制劑逆轉(n=4)； 注：與未用TNF-α處理組相比，*P<0.05，與TNF-α處理組相比，#P<0.05

3.p42/p44 MAPK通路參與了TNF-α對SIRT1的表達調節(jié) p42/p44 MAPK通路作為TNF-α的重要下游通路，在TNF-α與TNF-α細胞膜受體結合后被激活[11]。為了考察p42/p44 MAPK信號通路是否參與了TNF-α對SIRT1表達的誘導效應，我們首先檢測了TNF-α處理的血管平滑肌細胞中磷酸化p42/p44 MAPK蛋白的表達(圖3A)，Western blotting結果顯示：30 μg/mL TNF-α處理血管平滑肌細肌8h后，SIRT1表達增高的同時p42/p44 MAPK磷酸化信號也增強。另一方面，我們用p42/p44 MAPK通路的抑制劑PD98059(20μmol/L)提前處理血管平滑肌細胞30min，發(fā)現(xiàn)抑制這條通路后TNF-α對SIRT1表達的誘導作用也被抑制，說明p42/p44 MAPK通路在TNF-α對SIRT1的誘導過程中起重要的作用。同時，我們也觀察到當利用JNK抑制BP600125(10μmol/L)或P38抑制劑SB202190(10μmol/L)預處理血管平滑肌細胞30min后，再用30μg/L TNF-α處理8h, Westem blotting結果，顯示TNF-α對SIRT1的誘導效應也有不同程度的降低(圖3B)。

討 論

頸總動脈球囊損傷模型是血管炎癥損傷的經(jīng)典模型，血管平滑肌細胞在炎癥因子的刺激下遷移到內膜下層并增殖形成新生內膜。TNF-α是參與頸總動脈球囊損傷及冠狀動脈支架植入后再狹窄關鍵炎癥因子[9,12-13]等等。我們在大鼠頸總動脈球囊損傷模型中觀察到SIRT1表達增高；細胞水平實驗結果提示TNF-α誘導VSMCs細胞中SIRT1表達增加。結合細胞水平的實驗的結果，我們至少可以推測TNF-α是造成SIRT1在球囊損傷頸總動脈中表達增加的原因之一。

Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶SIRT1的抗炎效應已有大量報道，主要是通過抑制炎癥轉錄因子NF-κB來抑制TNF-α，IL-6等炎性細胞因子的表達，繼而抑制炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展[7,14-15]。而本研究中觀察到在血管平滑肌細胞中炎癥因子TNF-α增加SIRT1的表達。SIRT1在血管平滑肌受到不良刺激時表達增高具有什么樣的生理意義呢？我們推測SIRT1可能在血管平滑肌細胞的炎癥反應中起到一個平衡調節(jié)的作用，即不良因素的刺激一方面促進炎性基因TNF-α的表達，而另一方面增加的炎癥因子TNF-α又可以通過某些機制促進SIRT1的表達，SIRT1和TNF-α之間的這種負反饋效應在一定程度上可以抑制由于損傷刺激導致的血管平滑肌細胞的過度炎癥反應，使得細胞對損傷刺激的反應處于適度的水平。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的大亞基p65參與了TNF-α對SIRT1表達的上調作用[8]。本研究中，我們主要關注MAPKs信號通路對SIRT1表達的影響。MAPKs信號通路是TNF-α激活的細胞內重要信號轉導途徑，包括p42/p44 MAPK、P38MAPK、和JNK三條通路。其中，JNK和p38MAPK對SIRT1的正向調節(jié)已有文獻報道。而p42/p44 MAPK對SIRT的調節(jié)還未有報道。Nargis Nasrin等發(fā)現(xiàn)JNK可以通過使SIRT1磷酸化來提高其活性[16]；而用p38 MAPK的抑制劑則可以抑制Icariin對SIRT1表達的誘導作用[17]。與先前的報道一致，本研究中我們發(fā)現(xiàn)JNK和P38 MAPK通路的抑制劑SP600125、SB202190均可以在不同程度上抑制TNF-α誘導的SIRT1的表達，同時，我們還發(fā)現(xiàn)MAPKs的另一條信號通路p42/p44 MAPK同樣能夠調節(jié)SIRT1的表達，用p42/p44 MAPK的抑制劑PD98059能夠顯著地抑制TNF-α誘導的SIRT1表達。在三條MAPKs的通路中，p42/p44 MAPK及JNK的抑制劑PD98059、SP600125對SIRT1的抑制作用較p38的抑制劑SB202190的抑制作用更強(圖3B)，我們推測， p42/p44 MAPK及JNK在TNF-α對SIRT1的誘導中起更重要的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)在球囊損傷的血管平滑肌及TNF-α處理的血管平滑肌中SIRT1表達增高，且p42/p44 MAPK通路參與了TNF-α對SIRT1的誘導作用。這將對于進一步研究SIRT1在炎癥狀態(tài)下的表達調控及深入理解SIRT1在炎癥中的作用奠定基礎。