白細胞介素-12基因缺陷促進內皮祖細胞浸潤改善缺血再灌注后心肌損傷的研究

李玉琳 張言真子 陳博雅 杜 杰

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指在心肌缺血基礎上由于心肌再灌注引起的二次損傷，是心肌梗死患者血運重建后心臟不良事件發生和死亡的主要原因[1-2]。對于已經接受冠狀動脈血運重建治療的心肌梗死患者，減輕手術后心肌IRI，最大限度保護缺血心肌非常重要。白細胞介素-12(interleukin-12, IL-12)是巨噬細胞、樹突狀細胞分泌的炎性細胞因子，由p35和p40亞基組成[3]。我們前期研究發現白細胞介素-12p35亞基(interleukin-12 subunit p35,IL-12p35)調控單核細胞向不同類型巨噬細胞分化，參與高血壓心臟纖維化和心肌梗死后心臟修復[4-5]。以上均提示IL-12有可能參與缺血再灌注損傷。本研究將通過IL-12p35基因缺陷小鼠構建心肌IRI模型進一步探討IL-12調控心肌損傷的病理機制。

材料與方法

1.材料及分組 (1)材料：雄性，C57小鼠，16只, 購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司；雄性，IL-12p35基因敲除型(IL-12p35 缺陷)小鼠，16只, 購自美國The Jackson Laboratory。所有的動物的使用均遵循美國健康國立研究所出版的實驗動物照料和使用指南和首都醫科大學實驗動物照料和使用規則。Protein G Agrose/ Salmon Sperm DNA(美國Millipore公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒(美國羅氏公司)；抗CXCR4、抗VEGFR一抗(美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記免疫組化二抗(中國北京中杉金橋公司)；反轉錄試劑盒(美國Promega公司)。

(2)分組：分成四組：野生型 (WT)假手術組；白細胞介素-12p35亞基(IL-12p35)基因缺陷假手術組；WT手術組；IL-12p35基因缺陷手術組。

2.實驗方法 (1)小鼠缺血再灌注模型：小鼠稱質量后用異氟烷 (35 mg /kg) 吸入麻醉，麻醉誘導時間約2 min；用脫毛膏脫去小鼠胸部的毛，將小鼠平躺并固定，使用75%乙醇皮膚消毒；開胸位點選擇左側肋骨3～4 肋間，用眼科剪在此位置開口尺寸 0. 5～1. 0 cm；將小鼠心臟擠出；于左心耳右下緣2 mm處以6. 0絲線結扎冠狀動脈前降支，局部心肌由紅色變為白色，提示結扎成功；45min后解開結扎，關閉胸腔，用3/0的棉線縫合皮膚。假手術組小鼠也接受同樣的手術步驟，但是環繞前降支的線不結扎。

(2)組織切片制備：實驗結束時處死小鼠，使用0.9%氯化鈉液進行心臟灌流。心臟內注射10 %氯化鉀，使其停跳于舒張末期。心臟于10%甲醛溶液中固定后立埋于石蠟包塊中(心底向下，心尖向上)，5μm切片，自顯露乳頭肌后收片，將組織切片置于多聚賴氨酸涂層玻片上。

(3)流式細胞術[6]：處死小鼠后取結扎線以下的缺血再灌注部位心臟組織，在medium A中洗3次；將心臟轉入少量A中，用剪刀剪成1mm2左右的碎塊；將碎塊轉入2mL消化液1中，37℃, 25min；1 200r/min，離心8min，棄上清，加A洗一次，棄上清；加入1mL消化液2，37℃,45min；加入A稀釋消化液后，過300目細胞篩，1 200 r/min離心8min，棄上清，加A洗一次，棄上清；加PBS或鞘液，1 200 r/min，離心8min，棄上清，加入100μL PBS重懸細胞；加入Sca-1、CD34、VEGFR、CXCR4流式抗體，4℃避光,孵育30min，加PBS終止抗原抗體反應，1 200r/min離心5min，棄上清，加入約500μL PBS重懸細胞，細胞經表面染色后準備流式細胞儀上機檢測。

(4)免疫組織化學染色：1×檸檬酸中抗原高壓熱修復，ddH2O洗2次，各3min；內源性過氧化酶阻斷劑20min，PBS洗3次，各3min；血清封閉，室溫20min；甩干，加一抗抗體，4℃濕盒過夜；取出濕盒，室溫放置20min，PBS洗3次，各3min；加辣根過氧化物酶標記二抗抗體 30min，PBS洗3次，各3min；DAB顯色；蘇木素復染3min，自來水洗，鹽酸乙醇分化數秒，自來水沖洗5min；脫水、透明、封片及鏡檢。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進行切片觀察，采用400倍視野采圖。

(5)小鼠心臟組織RNA的檢測：RNA提取按Trizol提取試劑盒操作說明書進行。取缺血再灌注后小鼠梗死區、周邊區和遠端區心臟組織放入勻漿器，加入1 mL Trizol提取RNA，用Nanodrop 2 000測定RNA的濃度和OD260 /280 比值。按試劑盒說明將mRNA反轉錄為cDNA，分別加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL、RNase Free H2O 9μL和上下游引物各0.5μL，混勻。每管總反應體系20μL，加入到上述各管中，進行Real-time PCR反應，按照特定最適退火溫度進行擴增。采用Bio-Rad iQ5實時定量PCR儀進行實驗，進行融解曲線分析后獲得可靠CT值曲線。引物序列分別為: VEGFR∶5′-TGGCTCTACGACCTTAGACTG-3′ (上游)，5′-CAGGTTTGACTTGTCTGAGGTT-3′(下游)；CXCR4∶5′-CTTCTGGGCAGTTGATGCCAT-3′(上游)，5′-CTGTTGGTGGCGTGGACAAT-3′(下游)；IFN-γ：5′-ATGAACGCTACACACTGCATC-3′ (上游)，5′-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3′(下游)；GM-CSF：5′-TCGTCTCTAACGAGTTCTCCTT-3′ (上游)，5′-CGTAGACCCTGCTCGAATATC-3′(下游)；GAPDH:5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′(上游)，5′-GCGGCACGTCAGATCCA-3′(下游)。

(6)心臟超聲的測定:應用1%的戊巴比妥鈉(50mg/kg)進行腹腔注射麻醉；用脫毛膏將小鼠胸部的毛發脫去；將小鼠平躺并固定；用連接好的探頭對動物開始掃描成像，并保存圖像；將所保存的圖像導入分析軟件中進行分析，將算出的數據進行統計。

圖1 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心肌纖維化面積 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 Masson 染色心臟橫截面圖(×40，500μm)；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 Masson 染色陽性面積, 注: 與對照組相比，*P<0.05

3. 統計學方法 所有數據用SPSS 13.0 軟件進行統計。符合正態分布的測量數據以均數±標準差表示, 兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用方差分析, 偏態分布的計量資料采用秩和檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1. IL-12基因缺陷促進缺血再灌注后心臟修復 IL-12p35基因缺陷和同窩對照小鼠行缺血再灌注手術。術后14天收取心臟組織，病理顯示IL-12 p35基因缺陷小鼠心臟纖維化面積顯著小于同窩對照小鼠(圖1)。超聲顯示缺血再灌注后小鼠較假手術組心臟收縮功能下降，缺血再灌注手術組中IL-12 p35基因缺陷小鼠射血分數和縮短分數高于同窩對照組(表1)，表明IL-12 p35基因缺陷促進缺血再灌注后心臟修復和心功能。

表1 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心功能

注： IVS:d室間隔舒張末期厚度；LVID:d左心室舒張期內徑；LVID:s左心室收縮期內徑；LVPW:s左心室后壁收縮期厚度；LVPW:d左心室后壁舒張期厚度；EF：射血分數,注: IR：4W，與對照組相比，*P<0.05

2. IL-12基因缺陷不影響心肌細胞凋亡 缺血再灌注致心肌細胞凋亡是導致心肌損傷的主要原因之一。IL-12p35基因缺陷和同窩對照小鼠行缺血再灌注手術，術后1天收取心臟組織TUNEL檢測心肌細胞凋亡結果表明, IL-12基因缺陷小鼠與同窩對照小鼠心肌細胞凋亡,差異無統計學意義(圖 2)。

圖2 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心肌凋亡數量 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織 TUNEL染色(×40，500μm)；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織TUNEL染色陽性面積, 注: 與對照組相比，* P <0.05

圖3 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心臟中EPC趨化因子GM-CSF表達及EPCs數量 A：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中GM-CSF、VEGF-R、CXCR4 mRNA表達水平；B：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織免疫組化VEGFR、CXCR4染色(×400，50μm)；C：WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織免疫組化染色陽性面積統計結果；D：用流式細胞術檢測WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織中Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+細胞；E：流式細胞術檢測WT和IL-12p35基因缺陷小鼠心臟組織中Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+ 細胞數量 注: 與對照組相比，*P<0.05

3. IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心臟中EPC細胞增加 缺血再灌注后7天后,檢測心臟中EPC招募相關的趨化因子(GM-CSF)表達以及EPC細胞表面受體CXCR4和VEGFR表達。qRT-PCR檢測顯示, 缺血再灌注后心臟中GM-CSF, CXCR4和VEGFR的mRNA表達顯著升高(圖3A)。IL-12p35基因缺陷和同窩對照小鼠行缺血再灌注手術。術后7天收取心臟組織，免疫組化染色顯示， IL-12p35基因缺陷小鼠再灌注區域VEGFR，CXCR4陽性細胞面積顯著高于對照組(圖 3B～C)。流式檢測心臟中浸潤的Sca-1+CD34+VEGFR+CXCR4+的EPC細胞，缺血再灌注后心臟中EPC細胞高于假手術組；與對照組相比，IL-12p35基因缺陷小鼠再灌注部位中EPC細胞比例高于對照組小鼠(1.0%vs. 0.38%)(圖 3D～E)。以上結果表明IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注后心臟中EPC細胞增加。

圖4 WT和IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心臟中IFN-γ及GM-CSF表達 A：WT和IL-12p35 基因缺陷小鼠缺血再灌注術后心臟中IFN-γ mRNA表達水平；B：WT和IL-12p35 基因缺陷小鼠缺血再灌注術 后心臟中GM-CSF mRNA表達水平

4.IL-12抑制GM-CSF表達 qRT-PCR檢測表明，缺血再灌注后心臟中IFN-γ和GM-CSF表達增加，與缺血再灌注后同窩對照小鼠相比，IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中IFN-γ表達下降，但GM-CSF表達增加(圖 4)。

討 論

本研究利用IL-12p35基因缺陷小鼠構建缺血再灌注模型，闡明了IL-12在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用，IL-12敲除后可降低IRI后心肌纖維化面積，改善小鼠心功能(提高射血分數等心功能指數)，但不影響心肌細胞凋亡。進一步研究發現IL-12基因缺陷通過抑制IFN-γ減少對趨化因子GM-CSF的抑制，促進梗死區EPC的浸潤、血管生成、挽救瀕死心肌。

IL-12由巨噬細胞、樹突細胞分泌，主要通過與NK細胞和T細胞上的IL-12受體結合，誘導TNF-γ的產生，從而促進細胞介導的免疫反應[7]。近年來IL-12作用機制的相關研究已經涉及除感染以外的多種疾病，越來越多的證據表明IL-12在心血管疾病起重要作用。例如，IL-12基因缺陷通過內皮一氧化氮合酶/Akt/血管內皮生長因子受體2/氧化應激-炎癥依賴的信號通路促進2型糖尿病小鼠的血管生成及血流恢復[8]；ST段抬高型心肌梗死患者血清中IL-12顯著升高[9]；動脈粥樣硬化斑塊內的免疫細胞分泌IL-12刺激活化的T細胞產生IFN-γ[10]，IFN-γ通過降低膠原產生、平滑肌細胞增殖進一步促進斑塊進展和破裂[11]。本課題組的前期研究顯示急性心肌梗死后IL-12表達增加，通過調控單核細胞血管新生和炎癥相關基因表達，參與影響心臟損傷和重塑過程。

心臟缺血再灌注損傷的機制并未完全闡明，其中血管新生障礙在其中起著重要作用；由血管內皮細胞引起的血管新生在心肌梗死早期可挽救缺血心肌，因此促血管新生被公認是治療急性心肌梗死的潛在治療策略。內皮祖細胞(EPC)來源于造血干細胞，主要維持內皮完整性和功能并促進血管新生[12-13]。近幾年研究發現， EPC具有歸巢于血管損傷部位的能力，參與缺血性心肌損傷的修復[14]。我們檢測了對照小鼠和心肌梗死后小鼠心臟梗死區和交界區EPC細胞數量，發現心肌梗死后EPC從骨髓動員至梗死區浸潤增加，參與心肌修復和血管再生。進一步研究發現相比于野生小鼠，IL-12p35基因缺陷小鼠缺血再灌注后心臟中EPC細胞數量進一步增加。

趨化因子是作為化學引誘物誘導細胞遷移的一類蛋白[15]，EPC的動員由趨化因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)介導，可以促進EPC募集至缺血組織中并促進新生血管生成[14]。研究發現，IL-12可以抑制輔助性T細胞(helper T cells, Th)產生GM-CSF，IL-12受體敲除的Th細胞可以產生更多的GM-CSF；并且給予中和抗體阻斷IL-12后，Th細胞產生GM-CSF也會增多[16]。因此，我們檢測了缺血再灌注7天后心臟中GM-CSF的表達，結果發現缺血再灌注損傷后心臟中GM-CSF的表達量升高。我們之前研究發現IL-12基因缺陷后抑制T細胞向Th1型分化，從而減少對GM-CSF表達的抑制。我們檢測了缺血再灌注模型后心臟IFN-γ和GM-CSF的表達，發現IL-12p35基因缺陷小鼠心臟中IFN-γ的表達減少，而GM-CSF的表達增加。

綜上所述，本研究進一步揭示和證明了IL-12基因缺陷對于心肌IRI的保護作用，其機制可能是IL-12基因缺陷可以通過抑制IFN-γ表達減少對趨化因子GM-CSF的抑制，促進EPC向缺血心肌部位的浸潤，從而促進血管生成、挽救瀕死心肌。本研究為逆轉臨床上發生的心肌缺血再灌注損傷及后續的心力衰竭提供了新的治療思路和靶點。