不同誘變處理對紫花苜蓿生理生化指標的影響

申曉慧，馮 鵬，李如來，姜 成，李增杰，李志民，王 強

（1黑龍江省農業科學院佳木斯分院，黑龍江佳木斯154007；2佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯154007；3黑龍江省農業科學院作物育種研究所，哈爾濱150001）

0 引言

引起作物誘變變異的外界因素主要有兩個方面，一是物理因素，二是化學因素。作物誘發變異與自然變異相比較，具有如下特點：誘發變異能夠增加突變頻率、擴展變異類型、加大基因重組幾率、拓寬突變譜等特征，縮短篩選出具有利用價值的突變單株，減少育種年限[1-4]。當前，國內植物誘變技術已經很成熟，技術方法多樣化，在物理誘變、化學誘變乃至航天誘變研究方面均取得了良好效果，并在誘變機理分析方面進行了詳細研究，同時針對植物特異性目標進行不斷改良、優化，極大地提高了作物誘變效率。然而不同誘變處理方式影響著植物生長發育的不同方面，生理生化研究是誘變育種選擇的重要輔助手段之一。任衛波等[5]利用實踐八號搭載苜蓿種子研究表明，苜蓿誘變后糖類與脂類含量較誘變前下降。尹淑霞等[6]采用60Co-γ射線輻照黑麥草種子，研究結果發現黑麥草經60Co-γ射線輻照后，其過氧化物同工酶發生變化，后代材料中POD同工酶酶譜特征也因輻照劑量不同而變化。韓微波等[7]利用衛星搭載苜蓿種子研究其生理特性，結果表明，搭載后不同苜蓿品種苜蓿過氧化氫酶(POD)活性呈現增加趨勢，可溶性蛋白含量有升高，但超氧物歧化酶(SOD)活性則下降。李秀貞等[8]采用不同射線輻射如60Co-γ射線、激光、快中子輻射小麥種子，結果表明小麥可溶性蛋白質含量明顯增加，增加幅度最大的比對照材料高出9.09%。

紫花苜蓿(Medicago sativaL.)作為多年生豆科牧草在世界范圍內被廣泛種植。紫花苜蓿是中國牧草栽培面積最大，經濟、社會效益最好的豆科牧草[9-11]。目前，隨著中國種植業結構不斷調整和草地生態建設逐步壯大，苜蓿產業發展空間上升，種植面積尤其是紫花苜蓿種植數量呈逐年增加趨勢[12]。作為產糧和畜牧業大省的黑龍江省，地理位置特殊，具有緯度高、氣候寒冷的特性，但是其獨特的氣候條件特點，使一些高產高效紫花苜蓿品種的生產收到了極大限制。本試驗通過開展植物誘變技術對當地主栽品種進行不同誘變處理，通過分析其對生理生化指標的影響，以期篩選出適宜的誘變處理方法，為提高中國北方苜蓿抗性研究及苜蓿誘變育種提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試材

供試苜蓿品種為‘ 公農 1號 ’、‘Wega7F’、‘WL319HQ’、‘敖漢苜?！甒L319HQ’苜蓿種子由北京正道生態科技有限公司提供，‘Wega7F’、‘公農1號’、‘敖漢苜蓿’種子，由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 試驗設計

試驗于2015年12月對4種紫花苜蓿干種子進行誘變處理，方法如下：

60Co-γ射線：4個苜蓿品種種子進行60Co-γ射線輻照處理，設計劑量為150、300、450 Gy，以0劑量為對照處理，3次重復，處理時間為7天。

紫外線：選取篩選過苜蓿干種子將其包于紗布中，用45℃的蒸餾水浸泡1 h，之后0.1%的氯化汞溶液將處理好的種子進行消毒8～10 min。最后用無菌蒸餾水反復清洗3～5次，紫外燈瓦數為40 W，照射距離為距離種子同水平位置40 cm處，照射時間分別為30、60、90 min。3次試驗重復。

甲基磺酸乙酯(EMS)：選取篩選過苜蓿干種子，用濃硫酸浸泡4～5 min后蒸餾水反復沖洗5～6次。再用事先配置好的4℃磷酸緩沖液(100 mmol/L，pH 7.0)浸泡15 h使種子完全吸水膨脹。最后將種子浸泡在EMS濃度為0.1%、0.2%、0.4%(v/v)的溶液（磷酸緩沖液配制）再放置在室溫黑暗條件15 h，期間對種子進行搖動使其充分吸收藥液，之后蒸餾水反復沖洗，去除殘留種子表面的EMS溶液。試驗設3次重復。

不同誘變處理后種子盆栽，幼苗長至成苗時移栽至佳木斯分院苜蓿試驗田，苜蓿移栽株距30 cm，行距45 cm。期間正常苜蓿大田管理。

1.3 測定項目及方法

于紫花苜蓿盛花期（7月末）隨機采取10株新鮮功能葉片混勻用于各生理指標測定。氮藍四唑法[13]測定SOD活性，愈創木酚法[13]測定POD活性，紫外分光光度法測定過氧化氫酶(CAT)活性[14]。硫代巴比妥酸法[15]測定MDA濃度。考馬斯亮藍法[15]測定可溶性蛋白含量。蒽酮比色法[15]測定可溶性糖含量，磺基水楊酸法[15]測定脯氨酸含量。

1.4 統計分析

所采集試驗數據處理用Microsoft Excel 2007和SAS8.0(SASInstituteInc.,2006)軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘變處理對紫花苜蓿SOD活性的影響

由表1可以看出，不同誘變處理對紫花苜蓿葉片SOD活性影響不同。其中60Co-γ輻射處理促進了苜蓿SOD的積累，且均高于對照，150 Gy劑量下，除‘敖漢’苜蓿外，其他品種的SOD活性顯著高于對照，而450 Gy高劑量下，‘敖漢’的SOD活性顯著高于對照。除‘敖漢’外其他品種的SOD活性隨處理劑量的增加呈現下降的趨勢，而‘敖漢’苜蓿SOD活性變化與之相反；紫外線處理對苜蓿SOD活性變化表現為低劑量促進髙劑量抑制，且隨著處理紫外線照射時間的延長，除‘Wega7F’SOD活性呈現上升趨勢外，其他品種SOD活性均呈下降趨勢；EMS處理對4種苜蓿SOD活性的影響不顯著，SOD活性變化均隨處理劑量的增加而提高，低劑量處理下對SOD活性起抑制作用，高劑量下起促進作用。

2.2 不同誘變處理對紫花苜蓿POD活性的影響

由表2可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS處理對苜蓿POD活性的影響總體上表現為促進作用，不同誘變處理之間的促進程度不同，60Co-γ輻射對苜蓿影響為隨處理劑量的增加促進程度下降，紫外線處理則是隨著照射時間的延長POD活性增強，而EMS對苜蓿POD活性影響因品種不同而不同，對‘公農1號’和‘WL319HQ’POD活性影響為隨EMS濃度的增加而增強，對另外2個品種的影響則是隨EMS濃度的增加而下降。整體來說，150 Gy60Co-γ、90 min紫外線處理對苜蓿POD活性提高較大。

表2 誘變處理對苜蓿過氧化物酶(POD)活性的影響 U/(g FW·min)

2.3 不同誘變處理對紫花苜蓿CAT活性的影響

從表3中可知，苜蓿CAT活性在不同種類誘變處理下總體上表現為促進作用大于抑制作用，苜蓿CAT活性變化隨60Co-γ處理劑量的提高呈下降趨勢，除對‘敖漢’苜蓿CAT活性表現低劑量促進，高劑量(450 Gy)抑制外，對其他品種均表現為促進作用，‘公農1號’、‘Wega7F’和‘WL319HQ’CAT的活性在紫外線處理下表現為隨照射時間的延長而提高，其中‘WL319HQ’的CAT活性提高最大，最大值為731.73 U/(g FW·min)，是對照的2.57倍，紫外線處理想‘敖漢’苜蓿的CAT活性呈現出高-低-高的變化趨勢，30、60 min紫外線處理抑制了‘敖漢’?！r1號’、‘Wega7F’和‘WL319HQ’的CAT活性在EMS處理下呈現增加趨勢，‘敖漢’苜蓿的CAT活性在0.1%和0.4%的EMS濃度下呈增加趨勢，且與對照達到差異顯著(P＜0.05)水平。

2.4 不同誘變處理對紫花苜蓿MDA濃度的影響

從表4中可知，不同誘變處理下供試苜蓿品種細胞MDA濃度變化不顯著，多數誘變處理對MDA濃度的影響以增加為主。60Co-γ輻射處理提高了‘公農1號’和‘Wega7F’的MDA濃度，150 Gy的60Co-γ輻射降低了‘WL319HQ’和‘敖漢’苜蓿的MDA濃度，低劑量紫外線處理下各品種MDA濃度下降，90 min紫外線處理下MDA濃度略有增加，除‘敖漢’苜蓿外，各品種在0.1%的EMS處理下MDA濃度均高于對照，且隨著EMS濃度增加MDA濃度呈下降趨勢，0.4%EMS處理下各品種的MDA濃度均下降。

表3 誘變處理對苜蓿過氧化氫酶(CAT)活性的影響 U/(g FW·min)

表4 誘變處理對苜蓿丙二醛含量(MDA)的影響 μmol/g

2.5 不同誘變處理對紫花苜?？扇苄缘鞍缀康挠绊?/h3>

由表5可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS處理后苜蓿植株葉片可溶性蛋白含量的影響不明顯，60Co-γ處理對各品種可溶性蛋白含量影響不同，‘公農1號’在60Co-γ輻射處理下可溶性蛋白含量變化趨勢表現為低促高抑，均達到顯著水平(P＜0.05)，在中、低濃度時，顯著促進了敖漢可溶性蛋白含量的提高‘，Wega7F’和‘WL319HQ’可溶性蛋白含量受60Co-γ輻射影響較小；‘公農1號’的可溶性蛋白含量在紫外線誘變處理下低于對照‘，Wega7F’‘、WL319HQ’和‘敖漢’在紫外線處理下可溶性蛋白含量表現為低濃度下降和高濃度提升；低濃度EMS處理抑制‘公農1號’和‘Wega7F’可溶性蛋白含量，高濃度EMS處理促其含量增加，EMS處理提高了‘WL319HQ’可溶性蛋白含量，對‘敖漢’可溶性蛋白含量影響呈現為低促髙抑的變化趨勢。

2.6 不同誘變劑處理對苜?？扇苄蕴呛康挠绊?/h3>

由表6可以看出，60Co-γ、紫外線和EMS對苜蓿植株葉片可溶性糖含量促進作用大于抑制作用，‘公農1號’和‘Wega7F’在60Co-γ處理下可溶性糖含量略低于對照，而‘WL319HQ’可溶性糖含量略高于對照，表明60Co-γ誘變處理對其有一定的促進作用，而對‘敖漢’可溶性糖含量的影響表現為低濃度的抑制和高濃度的促進；紫外線處理對‘公農1號’、‘WL319HQ’和‘敖漢’可溶性糖含量的影響表現為低劑量促進而高劑量抑制，但紫外線處理對‘Wega7F’可溶性糖含量的表現為促進作用；EMS處理對各品種可溶性糖含量影響各不相同。

2.7 不同誘變劑處理對苜蓿脯胺酸含量的影響

由表7可以看出，3種誘變處理對各品種苜蓿脯胺酸含量的影響不同，60Co-γ和紫外線處理對各品種苜蓿游離脯氨酸影響整體上表現為抑制程度高于促進程度，450 Gy60Co-γ輻照下，苜蓿脯氨酸含量高于對照，‘公農1號’和‘Wega7F’在紫外線處理下，游離脯胺酸含量明顯下降，‘WL319HQ’和‘敖漢’在紫外線處理下，低劑量下游離脯氨酸含量受到抑制作用，高劑量下受到促進作用，EMS處理下‘公農1號’和‘Wega7F’脯胺酸含量下降明顯，‘WL319HQ’和‘敖漢’脯胺酸含量提高，且隨濃度變化提高幅度不同。

表5 不同誘變處理對苜蓿可溶性蛋白含量的影響 mg/g

表6 不同誘變處理對苜?？扇苄蕴呛康挠绊?%

表7 不同誘變處理對苜蓿脯胺酸含量的影響 μg/g

3 討論

植物體內的活性氧自由基清除劑含量的高低對植物抗逆性具有十分重要的意義，超氧化物歧化酶(SOD)、過化物酶(POD)和過氧化氫化酶(CAT)三者在機體抵御脅迫損傷時相輔相成，共同發揮著保護作用[16]，為防止自由基傷害，使生物體內自由基保持在一個低水平狀態下[17-19]。苜蓿在受到外界環境條件誘變刺激時，細胞內自由基數量增加，這些自由基的產生會破壞正常的細胞代謝平衡及膜系統結構與功能的穩定性，加劇了膜脂過氧化作用，而細胞中的3種抗氧化酶系統如超氧化物歧化酶、過化物酶和過氧化氫化酶能夠在機體抵御脅迫損傷時相輔相成，對細胞共同發揮保護作用[20-21]。本試驗中，苜蓿SOD、POD和CAT活性在各誘變處理下總體上呈現出升高的趨勢，說明通過誘變可以提高苜蓿體內3種抗氧化酶活性，抗氧化酶活性的增加有利于清除氧自由基，防御誘變損傷。誘變后各品種MDA的含量表現為，除個別誘變處理略有升高外，其他處理均低于對照，也進一步說明抗氧化酶活性提高對苜蓿細胞代謝平衡起到協調和保護作用，避免了苜蓿受誘變脅迫的傷害。

可溶性蛋白和可溶性糖都可以通過調節滲透壓來抵抗脅迫損傷，進而對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用。本試驗中苜蓿植株葉片中可溶性蛋白和可溶性糖含量，既有顯著高于CK的，也有顯著低于CK的，其原因可能是：對于含量升高的苜蓿品種，可能是誘變處理造成苜蓿植株一定程度上的損傷，但其損傷仍在可調節范圍內，對于含量降低的苜蓿品種，可能是誘變處理對細胞產生了毒害作用，造成苜蓿體內可溶性蛋白和可溶性糖的部分降解，導致含量降低，形成不可修復的損傷。在正常生長條件下，植物細胞內游離脯氨酸含量一般較低，而在受到外界環境條件逆境脅迫時，為了能夠維持細胞正常代謝和生理活動，游離脯氨酸含量會大量積累，以抵御逆境的影響，為此，植物通過提高體細胞內游離脯氨酸含量來防御逆境脅迫[17]。本實驗中，高劑量的60Co-γ處理下，供試的各苜蓿品種的脯胺酸含量均高于對照處理，說明苜蓿在遭受60Co-γ誘變輻射時，可以通過提高其體內游離脯氨酸的積累，增強抵御逆境的能力；其他幾種誘變處理下，游離脯氨酸含量增減不一，說明誘變對苜蓿游離脯氨酸的影響因處理劑量和品種不同而不同。

4 結論

本研究采用3種誘變處理對4個苜蓿品種進行了誘變，通過分析當代苜蓿誘變植株生理指標可知，3種抗氧化酶活性增強，不同誘變處理對3種抗氧化酶活性的影響程度為POD提高最明顯，其次是CAT和SOD。丙二醛濃度受誘變處理影響不顯著，總體來說，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和游離脯氨酸含量在各誘變處理下均有不同程度增加，但對各指標含量影響因誘變處理劑量和苜蓿品種不同而不同。綜合分析酶活性及各滲透調節物質含量，可知150 Gy60Co-γ、90 min紫外線和0.4%EMS處理對苜蓿生理活性具有明顯提高作用。