茚三酮法測定茶葉游離氨基酸總量研究

涂云飛

摘要 鑒于茚三酮法測定游離氨基酸總量不夠穩定，本文對茚三酮法測定茶游離氨基酸的顯色反應時間與氨基酸濃度因素進行了條件優化，并考察了方法的準確度與精密度。結果表明，將200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液顯色體系均勻混合，沸煮結束后立即用自來水充分冷卻并加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值，所獲得的結果穩定可靠，適宜作為茶葉中游離氨基酸總量的測定條件。

關鍵詞 茶葉；游離氨基酸總量；茚三酮

中圖分類號 TS272.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）14-0235-01

Abstract In this paper，ninhydrin reaction parameters for determination of total free amino acid in tea samples were optimized.The results indicated that，the method was stable and reliable in the following cases：200 μL buffer（2×pH 5.6），200 μL water or tea extraction aqueous（tea to water was 1∶250，boiling 30 min），and 400 μL ninhydrin solution mixed sufficiently in one system，after boiling，the reaction system was cooled by tap water and then added 4.8 mL deionized water to colorimetric analysis at 570 nm，which was suitable to determine the total free amino acid in tea.

Key words tea；total free amino acid；ninhydrin

茶葉中的游離氨基酸除了含有組成蛋白質常見的20種基酸外，還含有含量較為豐富的非蛋白質組成成分的茶氨酸及γ-氨基丁酸。這些氨基酸不僅影響茶葉的口感風味，而且還是對人體健康有益的重要因子。

茚三酮作為常見的試劑用于游離氨基酸總量的測定[1-5]，其原理是基于水合茚三酮首先與氨基酸反應形成還原型茚三酮和氨氣，之后一分子水合茚三酮、一分子茚三酮和一分子氨氣縮合成Ruhemann紫（一種氨鹽）（圖1）。

鑒于現有茶葉中游離氨基酸總量采用茚三酮法的測定條件不夠穩定[6-10]，同時考慮到國標（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）的顯色體系操作步驟過于煩瑣。本文對試劑配制的簡化作了有益嘗試，并優化了顯色反應體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

儀器設備：尤尼柯UV-2010紫外可見分光光度計。主要試劑：十二水合磷酸氫二鈉（AR級，純度≥99%，浙江湖州化學試劑廠）；一水合檸檬酸（AR級，純度≥99.5%，成都市新都區木蘭鎮工業開發區）；茚三酮（AR級，純度≥95%，國藥集團化學試劑有限公司）；谷氨酸[（HPLC級，純度≥98.5%，西格瑪奧德里奇（sigma-aldrich）上海貿易有限公司]；去離子水（實驗室自制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑配制方法。①2×pH 5.6的緩沖液配制。將4.15 g十二水合磷酸氫二鈉和0.88 g一水合檸檬酸溶解于50 mL容量瓶中，并用去離子水定容至刻度，混合搖勻備用。②茚三酮溶液的配制。1×pH 5.6的緩沖液溶解茚三酮并定容至2%（w/v）（注：溶解時加入<10%體積分數的乙醇助溶）。③谷氨酸標準溶液配制。準確稱取0.1 g谷氨酸標準品，溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻后備用。

1.2.2 谷氨酸標準曲線的制作。分別準確移取谷氨酸標準溶液1.6、3.2、6.4、12.8 mL至25 mL容量瓶中，并用去離子水定容至刻度，搖勻后備用。

10 mL具塞刻度玻璃試管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL稀釋后的谷氨酸標準溶液和400 μL茚三酮溶液，搖勻，沸煮結束后立即用自來水冷卻后加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值。

1.2.3 茶葉樣品測定體系。10 mL具塞刻度玻璃試管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液，搖勻，沸煮結束后立即用自來水冷卻后加入4.8 mL去離子水，于570 nm處測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的谷氨酸標準溶液顯色

在試驗條件摸索的過程中發現，體系中若只加水不加緩沖液，需在長時間加熱的條件下才能顯淺紫色，且易褪色；這可能是因為在無緩沖體系的條件下，谷氨酸本身的pH值過低使反應難以進行。另外，若加pH 5.6的緩沖液反應后不立即冷卻和用水稀釋，則高濃度的谷氨酸標準液（如512 mg/L）反應會產生沉淀，且反應液變成黃紅色。同時，試驗過程中還發現，在無氯化亞錫或其他還原劑存在的條件下，顯色反應即可進行，但保證氨基酸有效顯色的前提是反應過程中需要沸煮和過量的茚三酮。

在穩定反應條件的基礎上，谷氨酸標準溶液體系在加熱5～30 min過程中均呈現出藍紫色，但512 mg/L谷氨酸標準溶液顯色時沸煮10 min以上即有細粒漂浮沉淀產生，且吸光值超過0.8，即濃度過高的氨基酸會對測定體系產生影響。由表1可知，在選定的64～256 mg/L谷氨酸標準溶液范圍內，沸煮10～30 min后吸光值隨濃度遞增呈現較好的線性關系，具體表現為：沸煮10 min的線性是Y=0.003 1X-0.003 5，R2=0.989 1；沸煮15 min的線性是Y=0.003X-0.071，R2=0.994；沸煮30 min的線性是Y=0.003X+0.002，R2=0.992。

2.2 方法的準確性考察

進一步對方法的準確性進行了標準溶液添加測定回收率試驗。選擇本底茶樣提取液游離氨基酸總濃度為32.8 mg/L的茶樣添加50、100、200 mg/L的谷氨酸標準溶液濃度，按上述方法測定的回收率，結果如表2所示。可以看出，不同濃度的添加量，其回收率在70%～82%之間。

2.3 方法的精密度考察

稱取0.1 g的干綠茶和抹茶分別加入25 mL去離子水沸煮30 min，自然冷卻后用去離子水定至25 mL，離心取上清液，測定結果如表3所示。可以看出，抹茶和綠茶的標準偏差分別為6.3 mg/L和3.3 mg/L；變異系數分別為4.2%和5.3%，2組間測定結果差異不明顯，說明方法穩定性較好。

3 結論

茶游離氨基酸總量法測定所采用的顯色試劑為茚三酮，鑒于反應中間產物在堿性條件下不穩定[9]，國標（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）規定，在用水配制該試劑過程中需加入氯化亞錫作為抗氧化穩定劑，耗時較長，試劑需要提前1 d配制，且茚三酮在水中的溶解度較差，從而使顯色體系操作步驟過于煩瑣。本文在酸性緩沖體系（pH值5.6）中，對試劑配制作了簡化處理，并摸索了適合氨基酸顯色反應的條件，即將200 μL的2×pH 5.6的緩沖液、200 μL水或茶葉水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液顯色體系均勻混合，并在一定時間沸煮結束后立即用自來水充分冷卻并加入去離子水充分混合測定，所獲得的結果穩定可靠，適宜作為茶葉中游離氨基酸總量的測定條件。

4 參考文獻

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