高效紫云英根瘤菌的選育

李晶　蔡少麗　林金新

摘 要 通過分離鑒定、回接及盆栽試驗(yàn)，篩選出能高效結(jié)瘤、具有高效固氮酶活性，能有效提高紫云英生物量的紫云英根瘤菌作為目標(biāo)菌株，制備液體菌劑應(yīng)用于田間試驗(yàn)并測定其效果。結(jié)果表明，本試驗(yàn)篩選出的3株目標(biāo)菌株均發(fā)揮了根瘤菌優(yōu)越的生物固氮作用，增加了根瘤菌數(shù)量，提高了紫云英的生物學(xué)產(chǎn)量，并以GL-L-6菌株表現(xiàn)為最優(yōu)。

關(guān)鍵詞 根瘤菌；紫云英；生物固氮

中圖分類號：S154 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.102

我國耕地面積占全球的7%，而年消耗氮肥占世界的30%，氮肥利用率僅10%～30%。人工施用化學(xué)氮肥流失率往往大于50%，多余的氮素會導(dǎo)致土壤酸化，破壞土壤和微生物原先的氮循環(huán)能力，因此微生物的生物固氮作用對于改善植物氮素營養(yǎng)、降低化肥的使用、減少環(huán)境污染、并保持可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義[1]。豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮功能發(fā)揮了極大的作用，全球每年生物固氮量約2.0億噸，豆科植物-根瘤菌的共生固氮體系占了65%～80%；為共生的豆科植物提供所需氮肥的50%～100%，因此豆科植物-根瘤菌間的共生固氮是自然界植物氮素最經(jīng)濟(jì)、最有效的來源[2]。

紫云英是一種綠肥作物，富含有機(jī)質(zhì)，有利于改良土壤、培肥地力、減少化肥用量，并改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本。用冬閑田地種植紫云英是充分利用冬季溫光資源解決耕地冬季閑置的有效途徑。紫云英一直是我國南方各省稻田主要綠肥肥源之一，種植面積較大，紫云英與優(yōu)良的根瘤菌菌株拌種使用可以大幅度提高紫云英畝產(chǎn)量。我國南方廣大地區(qū)長期以來就通過種植紫云英作物綠肥改善土壤理化狀況，提高土壤氮素營養(yǎng)，因此，大力發(fā)展紫云英種植對南方地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義[3-4]。

根瘤菌具有較強(qiáng)的宿主專一性，其共生固氮過程需要有合適的宿主，同時由于其屬于革蘭陰性菌，其環(huán)境生存能力低于芽孢桿菌，因此在紫云英根瘤菌的應(yīng)用推廣中，菌種的選育改良、優(yōu)化發(fā)酵工藝、采用合適的保存方法提高其存活率，對其應(yīng)用至關(guān)重要[5]。

1 材料與方法

1.1 根瘤的采集與根瘤菌分離鑒定

從生長狀況良好的紫云英植株根部選擇肥大、飽滿、粉紅色的根瘤，用水沖洗干凈，再用無菌水沖洗，濾紙吸干后，用75%乙醇浸泡2 min、0.1%氯化汞浸泡2～5 min，無菌水沖洗5～6次后，在無菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎。將擠出液接種至選擇性平板上，28 ℃培養(yǎng)，挑取長出的單菌落，再次進(jìn)行劃線，分離后獲得的單菌落移至斜面上保存，并進(jìn)行革蘭染色和形態(tài)學(xué)鑒定，此為獲得初步分離的根瘤菌菌株[6]。

1.2 根瘤菌回接試驗(yàn)

將分離到的紫云英根瘤菌培養(yǎng)后接種到經(jīng)催芽的紫云英種子上，在無氮培養(yǎng)液中培養(yǎng)，同時以不接種的紫云英作為對照。待接種處理后的紫云英結(jié)瘤，根據(jù)根瘤的大小、瘤重、有效瘤數(shù)量等指標(biāo)判斷根瘤菌菌種的優(yōu)劣。將保存結(jié)瘤能力較好的根瘤菌作為備選的菌株。

1.3 盆栽試驗(yàn)

進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，對根瘤菌菌株進(jìn)行篩選。選擇大小相近的紫云英種子，播種在盛有滅菌蛭石的塑料盆（15 cm×13 cm）中，每盆5顆種子，分別接種供試根瘤菌懸液1 mL，以不接種為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將植株置于白天28～30 ℃、夜間15～20 ℃、每天光照8 h的溫室中培養(yǎng)，依據(jù)結(jié)瘤情況及紫云英生長性狀選擇比較優(yōu)良的根瘤菌菌株。隨后以土培法對第二輪篩選得到的根瘤菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，選擇在多個紫云英品種上都能高效結(jié)瘤，并能有效提高紫云英生物量的根瘤菌為目標(biāo)菌株。

1.4 固氮酶活測定

紫云英的根瘤較小，為避免根瘤離體后影響真實(shí)酶活性，取紫云英完整根系置于10mL的小瓶子內(nèi)，采用乙炔還原法測定固氮酶活性，重復(fù)3次。

1.5 田間試驗(yàn)

將篩選得到的菌種在YMA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，得到紫云英根瘤菌液體菌劑，平板計數(shù)測定活菌數(shù)與雜菌率。按每1 kg紫云英種子加75 mL根瘤菌的比例拌種晾干后馬上播種。收獲時，觀察結(jié)瘤比例、數(shù)量、飽滿度、顏色等，測定紫云英產(chǎn)量增加情況。

1.6 植株總氮含量測定

植株含氮量測定按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)肥料》（NY 525-2012）中總氮含量測定方法進(jìn)行[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化獲得的根瘤菌

選取肥大、飽滿、粉紅色的有效紫云英根瘤15個，利用平板分區(qū)劃線法分離獲得單菌落11個，分別命名為GL-L-1、GL-L-2、GL-L-3、GL-L-4、GL-L-5、GL-L-6、GL-L-7、GL-L-8、GL-L-9、GL-L-10和GL-L-11。革蘭染色鏡檢均為大小一致的革蘭陰性桿菌。經(jīng)28 ℃培養(yǎng)3 d，出現(xiàn)肉眼可見單菌落，直徑2～8 mm，水泡狀、透明水潤，生長旺盛時可見流動膠質(zhì)，具備一般根瘤菌形態(tài)特征。

2.2 根瘤菌回接及盆栽試驗(yàn)結(jié)果

將初步分離到的11株紫云英根瘤菌進(jìn)行回接及盆栽試驗(yàn)，計數(shù)結(jié)瘤情況，計量根瘤鮮重、株鮮重、株干重，結(jié)果見表1。如表1所示，結(jié)果表明接種選育的根瘤菌對紫云英結(jié)瘤及長勢上都有明顯的促進(jìn)作用。未接種根瘤菌的植株沒有結(jié)瘤，接種根瘤菌的紫云英植株均明顯結(jié)瘤，結(jié)瘤數(shù)在15.1～26.2個/株；在植株鮮重上，接種根瘤菌的全部實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)，增幅73.91%～141.24%；其中菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9在結(jié)瘤數(shù)目及鮮重增重上較其他株更有上佳表現(xiàn)，故確定為目標(biāo)菌株，后續(xù)試驗(yàn)將圍繞這3個菌株開展研究。

2.3 固氮酶活性測定結(jié)果

判斷是否具有固氮作用，必須進(jìn)行固氮酶活性檢測。采用乙炔還原法測定根瘤還原乙炔為乙烯的濃度從而間接測定菌株是否有固氮酶活性及其高低。目標(biāo)菌株GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9固氮酶活性測定結(jié)果如表2所示，3株菌株均有固氮酶活性，并綜上試驗(yàn)結(jié)果，其中GL-L-6固氮酶活性最強(qiáng)，植株產(chǎn)量也最高。

2.4 田間效果試驗(yàn)

將3株目標(biāo)菌株分別制得的紫云英根瘤菌液體菌劑經(jīng)田間試驗(yàn)，收獲時觀察，可見結(jié)瘤數(shù)量多，根瘤飽滿，均以粉紅色有效根瘤為主。測定植株鮮重反映紫云英產(chǎn)量，并以未添加根瘤菌液培養(yǎng)的紫云英植株鮮重作為對照，其植株鮮重和計算得出的增幅見表3，分別經(jīng)GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌種播種培養(yǎng)后，紫云英產(chǎn)量增幅明顯，達(dá)91.5%以上，并以GL-L-6菌液拌種培養(yǎng)紫云英產(chǎn)量增幅最大，達(dá)121.88%。

2.5 植株總氮含量測定結(jié)果

測定3株目標(biāo)菌株的總氮含量，記錄于表4中。如表所示，經(jīng)GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌液拌種培養(yǎng)后對提高紫云英植株的含氮量有明顯效果，增幅達(dá)68.66%以上，并以GL-L-6增幅最大，達(dá)82.59%。

3 討論

比較了不同紫云英根瘤菌對紫云英的結(jié)瘤性、固氮酶活性、含氮量及提高紫云英產(chǎn)量的作用。試驗(yàn)結(jié)果肯定了GL-L-5、GL-L-6和GL-L-9菌株較其他8株根瘤菌優(yōu)越，在紫云英上接種選定的這3株目標(biāo)根瘤菌劑，均發(fā)揮了根瘤菌的生物固氮作用，增加了根瘤菌數(shù)量，提高了紫云英的生物學(xué)產(chǎn)量，并以GL-L-6菌株表現(xiàn)為最優(yōu)。選育出優(yōu)良性狀的根瘤菌菌株，制備微生物肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤氮素營養(yǎng)、保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境具有重要的意義。

優(yōu)化發(fā)酵條件，研究根瘤菌劑作為微生物肥料在土壤中的競爭狀況和存活時間，探究影響微生物肥料發(fā)揮作用的因素等問題，在與促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤固氮方面的功能進(jìn)行更細(xì)致的研究，才能為微生物肥料應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時，加快成果轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)高校、科研院所與企業(yè)的合作步伐，并切實(shí)加大推廣面積和創(chuàng)新力度，才能為全面實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展起到積極的推進(jìn)作用[9]。

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（責(zé)任編輯：劉昀）