腦黑質(zhì)單側(cè)注射魚藤酮制備帕金森小鼠模型方法的建立和行為分析

王普

【摘 要】目的：帕金森是目前醫(yī)學(xué)難題，尚缺乏有效的治愈措施，針對(duì)其相關(guān)研究成為醫(yī)學(xué)重點(diǎn)方向。目的：注射魚藤酮制備帕金森小鼠模型方法探討，并從行為學(xué)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)角度分析模型。本文實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)參考新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院谷爭(zhēng)、候田田、周度爽、趙二奇、趙營(yíng)在腦黑質(zhì)單側(cè)注射魚藤酮制備帕金森小鼠模型方法的建立和行為分析一文。方法：為了使得實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚯宄恼宫F(xiàn)效果，采取實(shí)驗(yàn)組、溶媒組和正常組來(lái)進(jìn)行。每組各10只清潔級(jí)NIH小鼠。實(shí)驗(yàn)組采用立體定向微量注射法將溶解于二甲基亞砜（DMSO）的魚藤酮注射入小鼠腦右側(cè)黑質(zhì)致密區(qū)，溶媒組以同樣的方法僅注射相同體積的DMSO，正常組不做任何處理。結(jié)果：建模后，正常組、溶媒組和實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠體重、爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分評(píng)分均較對(duì)照組和溶媒組建模后明顯下降（P<0.05）。建模后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦黑質(zhì)TH水平注射側(cè)腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元較對(duì)側(cè)明顯減少（P<0.05）。結(jié)論：魚藤酮能選擇性損毀黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，可較快建立穩(wěn)定的成功率較高的帕金森模型。

【關(guān)鍵詞】魚藤酮；腦黑質(zhì)；多巴胺神經(jīng)元；帕金森病

【中圖分類號(hào)】R742.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）15-0-01

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)采用的小鼠達(dá)到無(wú)特定病原（SPE）級(jí)且美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）要求的，由河南省華蘭生物小動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供的體重在22～25g之間。武漢三洹醫(yī)藥化工有限公司生產(chǎn)的魚藤酮，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的阿撲嗎啡、兔抗酪氨酸羥化酶、免疫親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）試劑盒，北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒，成都儀器廠生產(chǎn)的ST-5ND-B型小鼠腦立體定向儀，安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)的ZH-GSZ型高級(jí)顱骨鉆，還有日本尼康生產(chǎn)的免疫組織化學(xué)成像系統(tǒng)。

1.2 模型建立及分組

實(shí)驗(yàn)組、溶媒組和正常組隨機(jī)分得10只小鼠，均同等正常飼養(yǎng)，反復(fù)對(duì)其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)，當(dāng)確定沒(méi)有旋轉(zhuǎn)行為后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（1）實(shí)驗(yàn)組：腹腔注射水合氯醛350 mg·kg-1，將小鼠麻醉后，嚴(yán)格顱平位（使用耳欄在立體框架中穩(wěn)定小鼠頭部，前囟與后囟水平高度相差0.1 mm以下）固定于小鼠腦立體定向儀，注射靶點(diǎn)坐標(biāo)為：前囟門后3.0 mm；外側(cè)向中線1.3 mm；頭骨表面腹側(cè)4.7 mm，微量注射器抽取溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）的魚藤酮1 μL，0.5 g/L，速度為0.2 μL·min-1，緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn)，注射完畢留針5 min待藥物充分彌散，緩慢勻速拔針。給與碘伏涂抹消毒，撒少量青霉素粉末，縫合傷口。術(shù)后碘伏連續(xù)涂抹3 d/每日二次。（2）溶媒組：小鼠固定方法及注射靶點(diǎn)同實(shí)驗(yàn)組，給予DMSO注射，每只1 μL。（3）正常組：不做任何處理，與實(shí)驗(yàn)組和溶媒組給予相同的飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)。

1.3 行為檢測(cè)及評(píng)分 對(duì)三組小鼠進(jìn)行處理四周后，將阿卟嗎啡注射到三組小鼠的頸后皮下，這可以誘導(dǎo)小鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。注射后5分鐘左右，小鼠適應(yīng)環(huán)境了開(kāi)始進(jìn)行計(jì)時(shí)，記錄10分鐘內(nèi)各個(gè)小鼠旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。當(dāng)恒定自發(fā)性左側(cè)旋轉(zhuǎn)且比較穩(wěn)定，每小時(shí)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)超過(guò)210，除此之外，還會(huì)出現(xiàn)震顫、豎尾、活動(dòng)遲緩等異常表現(xiàn)，可以判定模型建立成功。

1.4 爬桿實(shí)驗(yàn) 選取一根直徑為1.5厘米長(zhǎng)為50厘米的木桿，在木桿頂端固定一個(gè)直徑為25厘米的軟木小球，同時(shí)為了防止木桿打滑，在木桿上纏繞紗布。木桿豎直放置，讓小鼠置于小球上面，做如下記錄：（1）小鼠從小球爬下來(lái)的時(shí)間；（2）完成上半段木桿爬行的時(shí)間；（3）完成下半段的爬行時(shí)間。根據(jù)時(shí)間的長(zhǎng)短進(jìn)行評(píng)分，如果3秒內(nèi)完成某一個(gè)過(guò)程記3分，如果3到6秒內(nèi)完成記2分，超過(guò)6秒的記1分。然后統(tǒng)計(jì)各組小鼠的得分情況。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠生存情況比較

溶媒組和正常組小鼠在6周觀察期間均未見(jiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)組小鼠在建模2周和3周后死亡。三組建模建模后小鼠的死亡率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 3組小鼠體質(zhì)量變化比較 結(jié)果如表1顯示，與建模前比較，對(duì)照組、溶媒組和實(shí)驗(yàn)組建模后4周小鼠體質(zhì)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。建模后對(duì)照組、溶媒組小鼠體質(zhì)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組和溶媒組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 爬桿實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表2所示，建模前，由于P>0.05，這樣針對(duì)三組小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的得分就失去了統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，沒(méi)有研究?jī)r(jià)值。建模后，只有實(shí)驗(yàn)組的P>0.05，其他兩組P均大于0.05，因此建模后的實(shí)驗(yàn)組小鼠的爬桿實(shí)驗(yàn)得分統(tǒng)計(jì)與建模前有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

帕金森已經(jīng)成為影響老年人中發(fā)病率逐步升高的一種疾病，嚴(yán)重影響著患者的生活，對(duì)患者家庭也是很大的負(fù)擔(dān)。但是目前為止，對(duì)于帕金森綜合征的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，因此影響著對(duì)其治療。目前普遍認(rèn)為是選擇性黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元缺失和泛素染色陽(yáng)性的胞質(zhì)中包涵體形成是導(dǎo)致PD的主要原因之一。目前的藥物對(duì)PD還無(wú)法從根本上進(jìn)行治療。因此針對(duì)PD的有效藥物的要發(fā)和篩選成為該領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。目前關(guān)于PD臨床前藥物療效的篩選主要在大鼠上進(jìn)行，在小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的報(bào)道還比較少，但是由于小鼠與人有比較高的基因同源性，因此在小鼠進(jìn)行建模研究，對(duì)PD藥物的研發(fā)具有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮定位給藥，會(huì)降低小鼠的死亡率，同時(shí)小鼠的病理學(xué)和行為學(xué)變化與人類帕金森患者比較類似，具有研究的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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